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【目的】研究大鼠卵巢切除后及雌激素和PTH补充治疗对腰椎Sclerostin、Wnt/β-catenin通路表达以及骨强度和骨量的作用;研究雌激素和PTH对大鼠卵巢切除导致的间盘退变的缓解作用及机制,以及间盘退变和药物干预后Wnt/β-catenin的变化情况;从椎体和椎间盘两个方面综合评估大鼠卵巢切除及雌激素和PTH干预后脊柱的退变情况以及退变过程中Wnt/β-catenin的变化情况。【方法】第一部分:选取3月龄雌性SD大鼠,分为伪手术组(Sham组)、单纯对照组(OVX组)、雌激素组(OVX+E2组)、PTH组(OVX+PTH组)和联合治疗组(OVX+E2+PTH组),行卵巢切除造模。术后正常饲养8周,第9周开始各组按实验设计给予药物干预12周。干预结束后测量大鼠腰椎骨密度,处死后取材,分别取各组L1检测MEF2A、MEF2C、MEF2D和SOST的m RNA表达量;取L2检测椎体Sclerostin表达量;取L3行Sclerostin和β-catenin免疫组化染色,并进行骨细胞密度测定;取L4行Micro-CT扫描评价骨小梁结构参数;取L5行生物力学测试;取L6行Western blot检测β-catenin蛋白含量;取血清检测P1NP及CTX-1。第二部分:选取3月龄雌性SD大鼠,分为Sham组、OVX组、OVX+E2组和OVX+PTH组,行卵巢切除术制造低雌激素性间盘退变模型。术后第9周开始各组按相应干预处理12周后取材。分别获取各组动物T12/L1及L1/2椎间盘行RT-PCR检测间盘组分及Wnt/β-catenin通路表达情况;取L2/3及L4/5椎间盘的髓核部分,提取核蛋白检测β-catenin表达量;对L5/6间盘行HE染色和免疫组化染色评价间盘退变情况;取L2利用Micro-CT分析终板退变情况;取L3-L4节段进行间盘生物力学测试,从功能上评价间盘退变情况。【结果】第一部分:(1)与Sham组相比,OVX组大鼠椎体中MEF2s和SOST m RNA表达增高,而OVX+E2组椎体中MEF2s和SOST m RNA表达比OVX组减低(p<0.05)。PTH能抑制MEF2s和SOST m RNA的表达量,而OVX+E2+PTH组与OVX+PTH组相比对MEF2s和SOST m RNA有更强的抑制作用。(2)与Sham组相比,OVX组大鼠椎体中Sclerostin阳性细胞数量增多,OVX+E2组椎体Sclerostin阳性细胞数量比OVX组减少。OVX+E2+PTH组椎体中Sclerostin阳性表达细胞量与OVX+PTH组相似。Western blot结果显示OVX组Sclerostin表达量高于其余4组,而OVX+E2组Sclerostin表达量与Sham组水平接近。OVX+E2+PTH组比OVX+PTH组对Sclerostin蛋白表达有更强的抑制效果。(3)Sham组椎体骨细胞密度为426.83±68.14#/mm2,OVX组降低至293.53±53.24#/mm2,而OVX+E2组椎体骨细胞密度提升至377.30±48.22#/mm2(p<0.05)。OVX+E2+PTH组的骨细胞密度是451.44±55.57#/mm2,比OVX+PTH组(463.81±64.92#/mm2)略低,但差异没有统计学意义。(4)OVX组大鼠椎体中β-catenin阳性细胞比Sham组减少,而OVX大鼠经雌激素治疗后β-catenin阳性细胞数量增加。OVX+E2+PTH组椎体中β-catenin阳性成骨细胞比例略高于OVX+PTH组。核蛋白Western blot结果显示OVX组椎体β-catenin蛋白浓度最低,OVX+E2组β-catenin蛋白浓度较OVX组有所提高,但仍未达到Sham组水平。OVX+E2+PTH组β-catenin蛋白浓度比OVX+PTH组略高。(5)与Sham组相比,OVX组大鼠椎体BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Conn.Dn显著减低,而BS/BV及Tb.Sp增高(p<0.05)。OVX+E2组椎体BS/BV、Tb.Th、Tb.Sp和Conn.Dn这四个指标均恢复到了伪手术组的水平(p>0.05)。OVX+PTH组椎体BV/TV和Tb.Th高于Sham组,而OVX+E2+PTH组与OVX+PTH组结构参数上的差异没有统计学意义(p>0.05)。(6)与Sham组相比,OVX组大鼠椎体生物力学性能明显降低,其中最大载荷减低了30.1%,刚度下降了34.5%,而断裂吸收能减低了36.4%(p<0.05)。与OVX组相比,OVX+E2组大鼠椎体最大载荷增加了27.2%,刚度提高了28.8%,而断裂吸收能增加了30.1%,但未恢复至Sham组水平。OVX+E2+PTH组椎体生物力学性能比OVX+PTH组有所提高,但差异没有统计学意义。(7)与Sham组(0.1748±0.01056 g/cm2)相比,OVX组大鼠腰椎骨密度降低至0.1419±0.01068 g/cm2,而雌激素治疗将去势大鼠腰椎骨密度提高至0.1596±0.01396 g/cm2(p<0.05)。与OVX+PTH组相比,OVX+E2+PTH组大鼠椎体骨密度有所增加(0.1909±0.0109 vs.0.1842±0.0088 g/cm2),但差异没有统计学意义。(8)大鼠卵巢切除后血清中P1NP和CTX-1均显著增高,OVX+E2组比OVX组CTX-1低17.8%,P1NP低7.2%,但差异没有统计学意义。OVX+E2+PTH组CTX-1和P1NP水平低于OVX+PTH组(p<0.05)。第二部分:(1)Sham组大鼠间盘结构正常,髓核中细胞主要为脊索细胞。OVX组大鼠髓核中脊索细胞大量减少,部分大鼠髓核中出现大量聚集成簇的类软骨细胞,纤维环出现明显裂隙,纤维排列紊乱,软骨终板内出现大量异位骨样组织。与OVX组相比,OVX+E2组和OVX+PTH组髓核内类软骨细胞数量明显减少,仍主要为脊索细胞,纤维环胶原排列较规则。OVX组大鼠间盘出现明显退变,组织学评分高于Sham组,雌激素和PTH治疗均能降低去势大鼠间盘的组织学评分(p<0.05)。(2)与Sham组大鼠相比,OVX组大鼠L2上终板表面出现许多小凹陷,表面颗粒感强,平滑程度明显变差,终板边缘变得不规则。经过雌激素或PTH治疗的大鼠,其终板表面平滑程度得到一定恢复。Sham组L2上终板平均孔隙率为13.96%,而OVX组孔隙率降为7.88%(p<0.05)。OVX+E2组和OVX+PTH组孔隙率分别提升至10.57%和11.29%,较OVX组增加(p<0.05),但仍未达到Sham组水平(p<0.05)。(3)与Sham组相比,OVX组Aggrecan、Col2a1 m RNA表达降低,而Col1a1、MMP-3和MMP-9 m RNA表达升高(p<0.05)。与OVX组相比,OVX+E2组和OVX+PTH组Aggrecan、Col2a1 m RNA表达提高,而Col1a1、MMP-3和MMP-9 m RNA表达降低(p<0.05)。OVX组Aggrecan和II型胶原染色强度低于Sham组,而MMP-3染色强度高于Sham组。与OVX组相比,OVX+E2组和OVX+PTH组Aggrecan和II型胶原染色强度增高,而MMP-3染色强度减低。(4)与Sham组相比,OVX组β-catenin、c-myc和cyclin D1 m RNA表达减低(p<0.05),表明去势引起间盘退变过程中伴随着间盘内Wnt/β-catenin通路表达的下调。而OVX+E2组和OVX+PTH组间盘内β-catenin、c-myc和cyclin D1 m RNA表达均高于OVX组(p<0.05)。免疫组化结果显示Sham组能观察到髓核细胞β-catenin染色,而OVX组β-catenin染色强度明显低于Sham组。与OVX组相比,OVX+E2组和OVX+PTH组髓核细胞β-catenin染色强度增强。大鼠髓核细胞核内β-catenin Western-Blot结果与免疫组化结果一致。【结论】(1)Sclerostin受雌激素的调节,其中可能涉及对MEF2的调控。雌激素与PTH联合应用对MEF2s及Sclerostin的抑制效果优于PTH单独应用。(2)雌激素和PTH能够提高Wnt/β-catenin通路活性,且雌激素与PTH联合应用比单独应用对Wnt/β-catenin通路有更强的激活作用。(3)与PTH单独应用相比,在大鼠腰椎骨量及力学性能上雌激素与PTH联合应用时效果无明显差异。(4)去势大鼠终板内髓窦体积减小,异位骨化程度提高,对间盘营养状态也有不良的影响,Aggrecan和II型胶原含量降低,而I型胶原、MMP-3和MMP-9表达升高,间盘出现退变。而雌激素和PTH能够提高终板内髓窦体积,改善间盘营养供应,提高Aggrecan和II型胶原含量,从而改善间盘退变程度。(5)去势大鼠髓核中脊索细胞逐渐消失,发生类软骨细胞化生,伴有Wnt/β-catenin通路表达降低。雌激素和PTH均能保持髓核中脊索细胞的数量,减少类软骨细胞数量,提高髓核中Wnt/β-catenin通路表达。