研究背景头颈癌是全世界范围内第六大常见癌症,上消化道的所有恶性肿瘤,从嘴唇的朱红边缘到食道的开始,都被称为头颈部癌症;其中90%以上是鳞状细胞癌,即头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinomas,HNSCC)。口腔癌占头颈癌的绝大多数,包括我国在内的东亚-东南亚地区是全球范围内口腔癌发病率最高的地区,且近十年来发病率并没有明显下降。其中口腔癌中超过90%的病理类型为鳞状细胞癌,即口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),其作为头颈部鳞癌中最常见的类型,已经引起人们极大程度上的重视。尽管手术、放化疗及靶向治疗等多学科单一治疗或联合治疗策略在OSCC中的应用在一定程度上取得了进步,但近20年来患者的生存获益改善有限,5年总生存率仅仅提高了 5%左右,与其他肿瘤相比差距显著(如乳腺癌、前列腺癌等5年总生存率提高了约15-30%)。基于TNM分期的预后预测及治疗方案选择的指导性,是OSCC和其他许多实体肿瘤的主要预后预测模式,然而随着肿瘤微环境特征的揭示,特别是肿瘤免疫微环境特征与肿瘤进展,及其治疗应答与预后关系的发现,证实了单一依赖TMN分期的癌症预后预测的信息不完整性,也揭开了基于肿瘤微环境局部及其系统性免疫标志物,评价预测癌症预后的研究。寻找具有癌症预后预测意义的免疫标志,揭示癌症局部免疫构成特征及其意义与机制是肿瘤研究领域的热点之一。原发性肿瘤是由癌细胞和其他许多其他非恶性细胞及非细胞成分组成。大量的研究已证明,肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)被与肿瘤相关且高度异质性的髓系来源细胞浸润,包括肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs),肿瘤相关树突细胞(Tumor-associated dendritic cells,TADCs),肿瘤相关中性粒细胞(Tumor-associated neutrophils,TANs)及髓系来源的抑制细胞(myeloid cell-derived suppressorcells,MDSCs)。对这些炎性细胞群体与癌症进展及其治疗应答与预后关系的研究,已显示出了重要的价值及意义。近年来,人们对中性粒细胞在癌症生物学中的作用越来越感兴趣,中性粒细胞在癌症中的作用和重要性在过去十年中变得越来越明显。中性粒细胞是人体抵御感染的第一道防线,对包括癌症在内的各种炎症信号都可产生反应,已被用于中性粒细胞分类的术语包括N1/N2中性粒细胞,TANs及MDSCs。虽然有大量的研究证明,中性粒细胞在癌症患者的外周血中积累,高循环的嗜中性粒细胞与淋巴细胞的比值(Neutrophil lymphocyte ratio,NLR)是许多癌症临床预后差的一个可靠的生物标志物,但在OSCC中的研究数据较少,大队列的研究数据对评价NLR在OSCC中的预测意义仍具有重要的意义。通常将肿瘤局部的中性粒细胞称为TANs,目前公认的表型为CD15+或CD66b+。中性粒细胞在炎症和癌症之间起着重要的联系,不仅在肿瘤的进展及治疗应答与预后也测中已显示出重要意义。新进对小鼠非小细胞肺鳞状细胞癌模型的研究发现,TANs在鳞癌的发生中起了重要的作用。还有研究表明TANs富集的肿瘤对TLR7激动剂、单独或联合PD-1阻断剂易产生耐药,采用吉西他滨耗竭CD11b+TANs可逆转其耐药。然而目前有关TANs的研究数据大多来自小鼠模型,有关人的研究数据尚少,因此,近年内TANs也成为肿瘤研究中的一个热点领域。近年来研究数据显示HNSCC,尤其是OSCC的发病率呈上升趋势,而人乳头瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)在OSCC中越来越多的被检出,。在对HNSCC样本的检测证实,HPV16和HPV18是主要的感染类型,而E7与宿主细胞的整合及其诱导的功能改变是导致其炎性微环境差异的主要因素之一。由此,HNSCC与HPV感染的关系及其对局部免疫环境与预后的影响,也成为近年来HNSCC治疗研究中备受关注的内容。已有研究显示HPV阳性和HPV阴性的HNSCC在生物学特性、治疗反应和患者预后方面是两种不同的实体瘤,如与HPV阴性的HNSCC相比,HPV 阳性患者的总体生存率明显更好,对放疗的敏感性好,其复发率也较低。对这种截然不同的生物学特性及其预后结果的机制研究发现,HPV相关及非相关HNSCC的局部免疫环境差异可能是关键因素之一,如巨噬细胞的数量与类型等。这种肿瘤中差异免疫细胞浸润对治疗的成功来说非常重要。局部中性粒细胞浸润反应在显微水平和分子水平上的肿瘤免疫微环境对了的炎性状态,而术前外周血中性粒与淋巴细胞比值(Neutrophil Lymphocyte rati o,NLR)反映了宿主整体炎性状态。NLR现已被公认为HNSCC的可靠预后标志物,并可预测隐匿性转移。但目前对OSCC患者中HPV的状态与TANs及其循环中NLR之间的关系有何临床意义的研究甚少。阐述人类OSCC患者HPV状态及其与外周NLR及TANs的关系及其临床意义,不仅为基于HPV的OSCC的分层,提高其精确预后预测模型提供新的数据依据,也将为基于癌症炎性环境差异的OSCC治疗策略的精确设置提供新的依据。本项研究选取了山东大学齐鲁医院81例OSCC患者为研究对象,采用了 P16组化染色(公认的HPV感染标志)及CD15染色(中性粒细胞标志分子),分析了 HPV与TANs及循环NLR的关系及其与临床预后的关系,并构建了 HPV18-E7的质粒并转染OSCC,利用液相芯片等技术分析了 E7转染对口腔癌细胞生物学特性的影响,筛选HPV18-E7感染对OSCC组织中性粒细胞浸润影响的关键差异因子,进一步通过GEO数据库及TCGA数据库的分析,验证和探讨了 HPV与中性粒细胞的关系对OSCC分层的意义,为解析TAN的浸润机制提供重要的数据依据。本项研究拟期为OSCC的精确分层及预后预测、个体化治疗方案的制定提供新的依据与思路。第一部分口腔鳞状细胞癌患者HPV表达和中性粒细胞的浸润目的1.检测CD15+中性粒细胞在OSCC中的浸润情况及其对OSCC患者临床病理特征的影响;2.分析OSCC中HPV表达状态及其对OSCC患者临床病理特征的影响;3.探究OSCC中CD15+中性粒细胞与HPV表达的相关性;4.分析CD15+中性粒细胞浸润及HPV表达对OSCC患者预后的影响方法1.收集标本及临床病理资料:在本项研究中,回顾性将在山东大学齐鲁医院接受过原发性和根治性切除术治疗的OSCC患者共计81例纳入队列,将他们的基本信息并从病案系统中调取并进行整合整理,同时运用走访和电话访问等形式收集患者的信息,包括患者的性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤临床分期、组织学分级、淋巴结转移、肿瘤放疗和化疗情况。2.制作组织芯片并进行免疫组化:使用免疫组化研究方法对OSCC组织标本进行处理,以检测分析CD15+中性粒细胞和P16(HPV)在OSCC组织中的表达情况,探究其与OSCC患者临床病理因素和预后的相关性。并通过数据分析,探讨OSCC患者组织中,浸润中性粒细胞的密度和HPV状态的相关性。3.数据统计分析:对所纳入的数据进行Kaplan-Meier曲线的生存率分析,同时做数秩检验。进一步再进行Cox比例风险模型的多变量分析,从而评估CD15+中性粒细胞浸润情况、HPV感染状态和患者生存期相关的预后因素。通过Spearman的rho系数,探究CD15+中性粒细胞浸润与HPV表达的相关性。结果1.免疫组化结果表明,OSCC组织标本中有大量的CD15+中性粒细胞浸润,高密度CD15+中性粒细胞与较高的临床分期(P<0.001)、比较差的组织学分级(P<0.001)、阳性淋巴结转移(P=0.014)等(P<0.001)相关,但是其与年龄、型别、吸烟史、饮酒史、肿瘤浸润大小和术后放化疗无明显相关性。2.部分OSCC癌患者中感染HPV(P16)表达上调,P16表达具有明显的异质性。HPV阴性状态与较高的临床分期(P=0.001)、比较差的组织学分级(P=0.002)、阳性淋巴结转移(P=0.005)、放疗(P=0.038)等相关,但是其与患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤浸润大小和术后化疗并没有明显相关性。3.根据免疫组化和数据检验分析,检测到CD15+中性粒细胞密度与HPV(P16)表达呈负相关(P<0.001)。也就是说,在HPV(P16)阳性表达组中性粒细胞浸润密度较低,而在HPV(P16)阴性组中性粒细胞浸润密度较高。4.生存率分析显示,在整个数据中,不同的中性粒细胞浸润程度和HPV表达类别之间的癌症相关存活率有显著差异。OSCC患者中,相对CD15+中性粒细胞低密度组,浸润的CD15+中性粒细胞密度高的组预后较差。而与之相对应的,相对HPV阴性表达组,HPV阳性表达组预后较好。此外,高密度CD15+中性粒细胞浸润是口腔鳞状细胞癌患者的独立预后因素(P<0.001)。结论1.OSCC中有丰富的中性粒细胞浸润,HPV在OSCC中表达有明显异质性;在OSCC中,浸润的中性粒细胞密度和HPV的表达成负相关。2.OSCC患者中,浸润的CD15+中性粒细胞密度高的组和HPV阴性表达组的预后较差,且高密度CD15+中性粒细胞和淋巴结转移是OSCC患者的独立预后因素。意义OSCC是头颈部癌症的一种类型,而HPV在头颈癌中被越来越多的发现。HPV在口腔和咽部的传播途径和持续性尚不清楚。然而,有很多迹象表明HPV通过性接触传播。HPV 阳性和HPV阴性的HNSCC在生物学特性、治疗反应和患者预后等方面是两种截然不同的实体瘤;在肿瘤免疫细胞浸润方面上,HPV 阳性和HPV阴性肿瘤之间存在着很大的差异。本项课题研究将OSCC定为具体研究对象,检测分析CD 15+中性粒细胞在OSCC中的浸润情况及HPV在OSCC中的表达情况,并且探究口腔鳞状细胞癌中CD15+中性粒细胞与HPV表达的相关性。发现了 OSCC中,HPV的表达和中性粒细胞浸润呈负相关这一现象。此现象结果的发现,为HPV病毒感染所造成的特定肿瘤免疫微环境对HNSCC,尤其对OSCC产生预后影响的原因提供了新的论点和证据,为进一步地进行相关可能机制研究提供了新的思路和启发。第二部分口腔鳞状细胞癌中HPV对中性粒细胞浸润影响的可能机制研究目的探究OSCC细胞系中过表达HPV18-E7对中性粒细胞浸润调控的可能机制。方法1.细胞培养:将Cal-27细胞在37℃、5%二氧化碳的恒温恒湿的规定培养箱中进行培养,并采用其中含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM完全培养液作为Cal-27细胞系的常规培养基。2.HPV18-E7质粒的构建:HPV18-E7-HA-Flag的全长cDNA序列购于美国Addgene公司,将目的基因插入在PCDNA3.1的框架上,此次质粒的基础构建和进一步包装工作与上海博尚公司合作完成。目的质粒命名为E7,空载质粒命名为PC。3.Cal-27细胞质粒转染:对OSCC的Cal-27细胞分别进行E7目的质粒PC和空载质粒的相关转染,并设立空白对照组Control。分别在24及48小时后转染完成时,收集三组细胞的无细胞上清液,并同时提取他们的蛋白和RNA,并运用western blot技术和实时定量PCR技术,对质粒转染后的细胞系进行检测,在蛋白质水平和mRNA水平探究HPV18-E7在口腔鳞状细胞癌中的表达情况,以此来检测质粒转染效率。4.相关质粒转染完成后三组细胞系的形态学的分析、增殖能力及凋亡水平检测:质粒转染成功后,在光学显微镜下对三组细胞进行形态学观察及分析;对相关转染完成后的三组细胞运用MTT方法检测它们增殖能力的变化及差异;对相关转染完成后的三组细胞运用流式细胞实验技术检测其凋亡水平的变化及差异。5.细胞因子和趋化因子检测:转染48小时后,收集三组不同条件下培养的口腔鳞状细胞癌细胞系的无细胞上清液,通过悬浮芯片技术,进行细胞因子和趋化因子的检测分析。并通过实时定量PCR技术,检测三组不同培养条件下的细胞上清液,验证分泌明显差异的细胞因子或趋化因子在mRNA水平是否同样分泌差异。6.免疫组化:通过免疫组化的方法检测分析IL(CXCL8)在口腔鳞状细胞癌组织中的表达情况,探究并验证其与CD15+中性粒细胞和P16(HPV)在OSCC组织中的相关性。7.数据统计分析:进一步使用Spearman的Rho系数检测方法探索在OSCC组织里中性粒细胞浸润和HPV表达分别与IL-8表达的相关性。8.肿瘤基 因 组 图 谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(http://cancergenome.nih.gov/)和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)分析验证:在 GEO数据库(GSE3292和GSE6791)和TCGA数据库中共计500余例头颈癌中,将标记HPV状态的数据提取并分析IL-8的差异表达情况,验证体内体外实验结果。结果1.成功构建了 HPV18-E7-HA-Flag靶向质粒DNA载体。2.成功将构建好的靶向质粒导入到Cal-27细胞中。通过qRT-PCR和Western Blot分析,发现HPV18-E7转染组中,HPV18-E7基因在mRNA表达水平上和蛋白质表达水平上明显高于PC空载质粒体转染组和空白对照组。3.三组细胞的形态在使用光学显微镜观察后发现并没有明显差异,即HPV18-E7-HA-Flag对Cal-27细胞的形态方面没有明显影响;三组细胞增殖能力的变化被使用MTT方法进行检测分析,结果观测到三组细胞增殖能力无明显差异,即HPV18-E7-HA-Flag对Cal-27细胞的增殖能力无明显影响;三组细胞的凋亡水平的变化应用流式细胞技术进行检测探索,结果发现三组细胞凋亡水平无明显差异,即HPV18-E7-HA-Flag对Cal-27细胞的凋亡水平无明显影响。4.液相悬浮芯片实验揭示:同对照组相比,HPV18-E7转染组中的IL-8的表达下调,而IL-1β,G-CSF及GM-CSF等其余多种细胞因子及趋化因子的表达水平在三组细胞中并无明显差异。并且IL-8的mRNA水平在HPV18-E7转染组及对照组同样存在的mRNA水平上的显著差异,使用qRT-PCR技术在细胞实验中得到了验证。5.免疫组化实验结果及相关数据分析结果直观分析得出,CXCL8(IL-8)在肿瘤组织中表达上调。IL-8(CXCL8)表达与CD15+中性粒细胞呈正相关(P<0.001),与HPV(P16)表达呈负相关(P<0.001)的结果也使用Spearman的Rho系数检验的方法分析得出。6.在 GEO 数据库(GSE3292 和 GSE6791)中发现,CXCL8(IL-8)在 HPV 阴性组中的表达明显上调。在TCGA数据库中共有约500例左右的头颈鳞癌,但是标记HPV状态的共112例,其中HPV阴性80例,HPV 阳性32例。在这112例标本数据中,同样是CXCL8(IL-8)在HPV阴性组中的表达明显上调。结论1.HPV18-E7-HA-Flag靶向质粒转染可以明显提高Cal-27细胞中HPV18-E7-HA-Flag的表达水平。Cal-27细胞进行HPV18-E7-HA-Flag靶向质粒转染后,其形态学、增殖能力、凋亡水平无明显差异。2.HPV18-E7阳性的OSCC细胞,可能通过下调IL-8的表达从而在一定程度上参与抑制中性粒细胞的浸润。意义肿瘤微环境的本质即相关的免疫炎性细胞及包括炎性因子在内的相关非细胞成分在特定的微环境中聚集并相互作用。其中,髓系来源的相关细胞等在肿瘤从发生到发展转移的整个过程中都起着相当重要的作用。实际上,免疫细胞可以直接清除肿瘤细胞或参与抗肿瘤反应的诱导,而肿瘤细胞则通过适当的训练招募并促进肿瘤的生长和进展。众多参与其中的免疫细胞中包括中性粒细胞。我们选择头颈肿瘤中的典型类型,OSCC,从HPV所造成的特定肿瘤微环境入手,以中性粒细胞为切入点,探究了致癌HPV过表达微环境对肿瘤中性粒细胞这个特殊细胞群体生物学行为的影响。发现在OSCC中,HPV或许通过下调中性粒细胞的趋化因子IL-8(CXCL8)的表达水平,抑制中性粒细胞的聚集,从而可能影响OSCC患者的预后结果。这为解析浸润的中性粒细胞在HPV阳性的OSCC中比HPV阴性的OSCC中少的可能机制提供重要的数据依据;并对理解包含OSCC在内的HNSCC生物学行为及肿瘤的转归意义重大,HPV和TAN作为癌症的潜在靶点,或许可以为HNSCC的新型的治疗手段的开发提供新的思路提供助力。第三部分HPV状态与口腔鳞状细胞癌患者外周血NLR的相关性分析目的1.探索NLR是否可用于定义OSCC的高危类型;2.探究NLR与CD15+中性粒细胞、HPV的相关性;方法1.收集标本及临床病理资料:在本项课题研究中,回顾性纳入在山东大学齐鲁医院内,接受过原发性和根治性切除术治疗的OSCC患者共计81例,将他们的信息从医院病案系统中调取,同时进行走访或者电话访问等形式收集将患者基本信息搜集整合,并这些收集到的信息计算得出NLR。2.数据统计分析:NLR的最佳临界值使用了 ROC曲线分析和You den’s指数公式计算方法得出,并通过此临界值将NLR分为两类,进一步进行运算分析。Kaplan-Meier曲线是进行生存分析的具体方法,计算后再进行对数秩检验。NLR分别与中性粒细胞浸及与HPV表达的相关性都采用了 Spearman的Rho系数检测方法进行了详细分析。结果1.通过数据分析发现,OSCC中,根据使用ROC曲线分析和You den’s指数(敏感性+特异性-1)确定的最佳临界值,对NLR分为两类进行分析:NLR≤2.925 vs NLR>2.925。。2.对81例OSCC患者的临床基本信息检测分析后得出,NLR>2.925可提示OSCC患者具有较差的总生存期(overall survival,OS)和无病生存期(disease-free survival,DFS)。3.根据免疫组化和数据检验分析,发现CD15+中性粒细胞在OSCC组织中局部浸润密度高的组,NLR较高;CD15+中性粒细胞在OSCC组织中局部浸润密度低组,NLR较低。而HPV为阳性时,患者的NLR较低;HPV为阴性状态时,患者的NLR则较高。在OSCC组织中浸润的CD15+中性粒细胞密度与患者术前外周血中NLR呈正相关,而HPV状态则与NLR呈负相关。结论1.在口 OSCC中与NLR≤2.925相比,NLR>2.925与患者较差的DFS和OS明显相关。2.OSCC中,局部浸润的CD15+中性粒细胞密度与NLR呈正相关。3.OSCC患者的致癌HPV的感染与患者整体炎性状态中NLR呈负相关。意义全身和局部炎症反应中,“短命”的中性粒细胞都起着重要作用。有研究报道中性粒细胞的上调可以反映癌细胞的侵袭性特征,这主要是由肿瘤细胞的造血细胞因子刺激而引起的。精氨酸酶、活性氧、一氧化氮等物质都可以由中性粒细胞所产生,这些物质可以抑制细胞毒性淋巴细胞的功能,同时,在宿主中淋巴细胞主要可以通过抑制肿瘤生长、侵袭及转移从而具有抗癌的活性。通过中性粒细胞和淋巴细胞的相结合计算得出的反映宿主炎性状态的整体指标,高NLR水平在先前的许多研究中已经被证明是癌症患者预后不良的一个有希望的新兴指标。我们通过体内体外实验和数据库验证,HPV或许通过下调IL-8的表达抑制局部了肿瘤组织里中性粒细胞的聚集或浸润,从而改变了特定肿瘤微环境中的局部炎性状态。在此,我们又将NLR这个参数加入到研究中,分析得到OSCC患者的致癌HPV的感染与患者整体炎性状态中NLR呈负相关。本项研究不仅从显微炎性水平探讨了局部中性粒细胞浸润与HPV状态的相关性及它们分别对OSCC患者临床病理特征的影响,还将患者整体炎性的指标之一 NLR纳入研究,为HNSCC及OSCC的治疗风险的评估、疗效的预测以及精准的个体方案制定提供新的思路及相关可能依据。