研究背景临床手术过程中,患者的循环功能会随着麻醉药物剂量及种类的变化受到不同程度的抑制,可能会导致严重的低血压,甚至可能引起心脏、大脑等器官血流灌注急剧下降,造成术后器官功能损害。作为临床麻醉医生,已经认识到对合并多种疾病(例如高血压、冠心病等循环系统慢性疾病,糖尿病等内分泌慢性疾病)的患者实施全身麻醉时,更应该选择合适的麻醉药物,尽量减少循环抑制产生的器官损害。临床麻醉过程中,麻醉药物对循环系统产生的抑制作用,主要是由于其抑制了心肌收缩功能,导致心输出量下降。cAMP依赖性蛋白激酶(cAMP dependentprotein kinase,PKA),能够激活多种受体,存在于心肌细胞肌质网上,在心肌收缩过程中发挥重要调节作用。心肌细胞激动剂,通过激动G蛋白(Gs),活化腺苷酸环化酶(AC)。后者引起心肌细胞内cAMP含量上升,cAMP再激活PKA。激活的PKA使多种功能蛋白磷酸化来发挥心肌收缩调节作用,被PKA磷酸化的心肌功能蛋白主要有PLN和ryanodine受体(RyR),从而使细胞内钙离子浓度上升,诱发胞内反应,并最终引起心肌收缩。异丙酚作为一种较为常用的全身静脉麻醉药物,其特点是较快地产生镇静,催眠效果,代谢迅速,输注停止后,患者能够快速清醒。临床报道及基础实验均表明,异丙酚有循环功能的抑制效应,部分表现为抑制心肌收缩功能,减少心输出量。本研究采用了 Langendorff离体心脏灌流技术,排除了全身其他器官对心脏的影响,监测不同浓度异丙酚对心脏收缩功能的影响,同时测定了 PKA及其调节的下游PLN、RyR蛋白的表达及磷酸化状态,分析异丙酚可能通过抑制PKA调节的钙离子相关通路降低心肌收缩力。异丙酚作为一种常用的镇痛和抗焦虑药物,常用于临床麻醉及重症监护,动物实验表明,异丙酚预处理可显著降低缺血再灌注引起的室性心律失常的发生率,心脏梗死面积。在世界范围内,由完全的或不完全的冠脉堵塞造成的缺血性心脏病是最重要的致死因素之一,缺血后立即再灌注可防止心脏骤停,但是心肌缺血再灌注使重新获得血液供应的心肌组织产生更加严重的损伤。心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury,MIRI)在临床麻醉过程中也较为常见,多种冠脉及心脏手术(例如冠状动脉溶栓术,冠脉血管成形术经皮冠状动脉介入治疗术,体外循环下心脏直视手术和心脏移植手术)随着升主动脉的阻断与开放,心肌组织也会发生心肌缺血再灌注损伤,影响患者的预后。MIRI的特点为局部细胞氧化破裂、凋亡和局部炎症反应引起的组织功能障碍,再灌注过程中释放出多种炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α等),引起局部炎症反应过度。CaMKII在此过程中被过度激活,使PLN、RyR2活性紊乱,可能会导致钙离子超载,进而引起心肌损伤。本研究采用离体心脏缺血再灌注模型及体外心肌细胞缺血再灌注模型,加入异丙酚或KN93干预,监测心脏功能,观察异丙酚对CaMKII的调节在缺血再灌注损伤中的作用。第一部分异丙酚部分通过抑制PKA活性降低大鼠离体心肌收缩目的静脉麻醉药异丙酚在临床麻醉过程中,对循环抑制的机制尚不明确。既往研究表明,异丙酚对心脏有直接抑制作用。本研究采用Langendorff离体心脏灌流技术,排除全身其他器官对心脏的影响,监测不同浓度异丙酚对心脏收缩功能的影响,同时测定PKA及其调节的下游PLN、RyR蛋白的表达及磷酸化状态,旨在明确异丙酚是否通过调节PKA磷酸化状态降低心肌收缩功能,并证明无β受体激动剂刺激时,异丙酚能否直接抑制PKA从而影响其下游蛋白抑制心肌收缩。方法本研究采用离体器官以及分子水平实验技术进行验证:将大鼠离体心脏悬挂于Langendorff灌流系统,注满水的球囊插入左心室内,监测正常左心室收缩幅度及其心脏功能指标,灌注含有异丙酚的KH液,浓度分别为10、20、30、40、50、100μM。观察大鼠左心室收缩幅度变化,选取抑制作用明显且接近临床浓度的50μM异丙酚及PKA抑制剂(H89)进行灌注,观察其对大鼠左心室收缩幅度的影响。收集Langendorff灌流后的心脏组织,一部分提取RNA及相关蛋白,一部分浸泡于4%多聚甲醛中,制作心脏组织冰冻切片。用ELISA法测定cAMP在组织中的含量,测定组织中PKA活性;采用RT-PCR、qPCR测定PKAmRNA表达量;采用免疫印迹测定PKA及其下游蛋白P-PLN/PLN、P-RyR2/RyR2蛋白表达量及磷酸化水平;采用免疫荧光法检测心肌组织中PKA磷酸化状态,使用非放射性PKA活性试剂盒检测心肌组织中PKA磷酸化状态。结果1.不同浓度的异丙酚对心肌收缩力的影响离体心脏在灌注异丙酚后,与正常心脏相比,左心室收缩幅度明显下降,并呈现剂量依赖性抑制作用,在灌注50μM异丙酚后,抑制作用较明显且接近临床药物浓度。2.异丙酚(50μM)及H89对心脏功能的影响大鼠离体心脏灌流50μM异丙酚后,左心室发展压(LVDP)及左心室内压上升速率明显下降。在灌注PKA抑制剂H89后,大鼠离体心脏LVDP及左心室内压上升速率明显下降,再灌注50μM异丙酚,离体心脏功能指标继续下降,冲洗后,只灌注50μM异丙酚,大鼠离体心脏LVDP及左心室压上升速率明显下降。3.不同浓度异丙酚对心肌组织中cAMP、PKA活性的影响cAMP检测结果显示,异丙酚并不影响cAMP的产生,而PKA活性检测结果表明,大于50μM浓度的异丙酚抑制PKA活性更显著。4.异丙酚(50μM)对心肌组织中PKA、PLN、RyR2mRNA的影响RT-PCR、qPCR结果显示,异丙酚灌流组、H89组与正常组相比,PKA、PLN及RyR2 mRNA转录量并未减少;异丙酚灌流组与H89组相比,PKA、PLN及RyR2 mRNA转录量没有明显变化,表明异丙酚及H89并未影响PKA、PLN及RyR2mRNA的表达。5.异丙酚(50μM)对心肌组织中PKA、PLN、RyR2蛋白表达及磷酸化状态的影响免疫印迹结果显示,异丙酚灌流组与正常组比较,P-PKA/PKA表达量显著减少,PKA下游信号蛋白P-PLN/PLN、P-RyR2/RyR2表达量明显减少。6.异丙酚(50μM)对心肌组织中PKA活性的作用与PKA磷酸化活性检测一致,心肌组织免疫荧光结果证实了异丙酚及H89能够抑制PKA磷酸化活性,减少了心肌组织中磷酸化PKA的含量。结论1.异丙酚对离体心脏收缩的抑制作用呈现剂量依赖性,而且不影响cAMP的生成。2.异丙酚部分通过抑制PKA调节的PLN、RyR2受体磷酸化,发挥对离体心脏收缩功能的抑制作用。3.无β肾上腺素受体激动剂刺激,异丙酚能够降低PKA活性抑制心肌收缩。第二部分异丙酚调节CaMKII在心肌缺血再灌注损伤中的作用目的MIRI的特点为局部细胞氧化破裂、凋亡和局部炎症反应引起的组织功能障碍,再灌注过程中释放出多种炎症因子,引起局部炎症反应过度。CaMKII在此过程中被过度激活,使PLN、RyR2活性紊乱,可能会导致钙离子超载,进而引起心肌损伤。本研究采用离体心脏缺血再灌注模型,体外心肌细胞缺血再灌注模型,加入异丙酚或KN93干预,监测心脏功能,观察异丙酚对CaMKII的调节在心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法采用离体心脏缺血再灌注模型,将大鼠离体心脏悬挂于Langendorfff灌流系统,左心室内插入球囊,监测离体心脏的功能指标。稳定20min后,停止灌注灌流液30min,后再灌注1h,造成心脏缺血再灌注状态。分别将CaMKII抑制剂KN93或者异丙酚加入到灌流液中,观察心脏功能指标,收集稳定期、缺血再灌注1Omin及60min时冠脉流出液,利用ELISA方法测定LDH、cTnI。收集缺血再灌注后的心脏组织,qPCR法测定IL-1、IL-6、TNF-α等指标,利用免疫印迹检测心肌细胞凋亡蛋白的变化,测定CaMKII及PLN、RyR2蛋白磷酸化水平的表达。培养原代心肌细胞,制作体外心肌细胞缺血再灌注损伤模型,分别加入KN93或异丙酚干预,利用免疫印迹测定心肌细胞CaMKII及PLN、RyR2蛋白磷酸化水平的表达。结果1.异丙酚能够稳定缺血再灌注后的心脏功能。与IR组比较,在缺血30min再灌注后,异丙酚及KN93促进了离体心脏收缩功能恢复,IR组心脏缺血再灌注后,心肌收缩不稳定,发生室颤;异丙酚及KN93处理组,心脏收缩功能恢复较快,室性心动过速及室颤发生频率明显减少。2.异丙酚对心肌缺血再灌注损伤CaMKII及PLN、RyR2磷酸化水平的影响异丙酚及KN93能够显著降低心肌缺血再灌注后CaMKII及PLN Thr17亚基、RyR2 S2814亚基的磷酸化水平,但是对总蛋白水平是没有影响的。3.异丙酚对冠脉流出液坏死标志物及心脏组织凋亡调节蛋白的影响异丙酚及KN93能够降低心肌缺血再灌注后冠脉流出液中LDH、cTnI的含量。异丙酚及KN93能够降低Bax的蛋白表达,增强Bcl-2的蛋白表达,抑制缺血再灌注后心肌细胞凋亡。4.异丙酚对缺血再灌注后心脏组织中炎症因子的影响异丙酚及KN93能够显著降低缺血再灌注后心脏组织中IL-1、IL-6、TNF-α的含量,初步说明异丙酚及KN93对心脏组织炎症因子产生的作用可能与CaMKII 有关。5.异丙酚对缺血再灌注后心肌细胞CaMKII及PLN、RyR2磷酸化水平的影响同心肌组织免疫印迹结果一致,异丙酚及KN93能够显著降低心肌细胞缺血再灌注后CaMKII及PLN、RyR2蛋白磷酸化水平。结论1.异丙酚能够稳定缺血再灌注后的心脏功能,减少VT和VF的发生率。2.异丙酚及KN93能够减少缺血再灌注损伤后CaMKII及PLN、RyR2的磷酸化水平。3.异丙酚及KN93能够减轻缺血再灌注后心肌细胞的损伤,减少炎症因子及心肌坏死标志物的产生,减轻心肌细胞凋亡。