笃斯越橘VcWRKY24与VcWRKY33基因克隆及功能分析

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笃斯越橘具有极高的抗寒能力,目前关于笃斯越橘的研究多集中在其果实品质和生理栽培等方面,而关于笃斯越橘适应逆境胁迫分子机理的研究却较少。因此,挖掘笃斯越橘中抗性基因,探究其在逆境胁迫下的分子机理,对培育抗逆越橘新品种具有重要意义。WRKY转录因子参与了植物的生长和发育过程中对逆境胁迫的响应,通过WRKY基因调控和表达有助于提高植物对逆境条件的适应能力。本研究以笃斯越橘组培苗为试材,克隆得VcWRKY24、VcWRKY33基因,对其基因序列及在不同组织、不同胁迫条件下的表达模式进行了分析;通过在拟南芥中分别过表达VcWRKY24、VcWRKY33,对这两个基因在响应盐胁迫和低温胁迫过程中所发挥的功能进行了研究。取得的主要研究结果如下:1.以笃斯越橘c DNA为模板,通过PCR扩增克隆得到笃斯越橘VcWRKY24、VcWRKY33基因。VcWRKY24基因和VcWRKY33基因的开放阅读框分别为1632 bp和1167 bp。序列分析结果显示VcWRKY24、VcWRKY33氨基酸序列中均含有两个完整的WRKY结构域,且C端含有两个C2H2锌指结构,属于WRKY第I亚家族。2.半定量PCR和荧光定量PCR结果显示:VcWRKY24和VcWRKY33基因的表达具有组织特异性,VcWRKY24基因和VcWRKY33基因在笃斯越橘根茎叶中都表达,且都在叶片中表达量较高;在盐胁迫(200m M Na Cl)和低温胁迫(4℃)条件下,VcWRKY24和VcWRKY33基因的表达量均随胁迫时间的增加呈先上升高后下降的趋势。3通过VcWRKY24、VcWRKY33基因的过表达,鉴定了VcWRKY24、VcWRKY33在拟南芥中响应低温和盐胁迫过程中的功能。在胁迫条件下,野生型拟南芥叶片萎蔫皱缩,受害严重,而VcWRKY24、VcWRKY33过表达植株的大部分叶片仍呈绿色,且生理指标的测定的结果也显示野生型与过表达植株间存在显著差异;恢复生长一周后,VcWRKY24、VcWRKY33过表达植株能显著提高其存活率。综上所述,过表达VcWRKY24、VcWRKY33基因能增强拟南芥抵御低温和盐胁迫能力。
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