壳聚糖酶的制备及应用

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壳寡糖是一种低分子量的壳聚糖,分子量在500-10000之间,水溶性比壳聚糖好,可以直接被机体吸收,现已广泛应用于医药、保健食品和农业领域中。壳寡糖的制备可分为物理降解法、化学降解法和酶降解法。目前市场上大多数壳寡糖生产仍然采用酸降解或氧化降解方法,其生产工艺复杂,对环境污染大,产品分子量大,溶解性和生物活性低。而酶解法反应条件温和、整个降解过程中无其他反应试剂的加入、不至于发生其它副反应、降解过程及降解产物相对分子质量分布易于控制、壳寡糖得率高、不造成环境污染。本研究所用的高产壳聚糖酶的微生物菌株是从自然界中分离筛选出的,经过鉴定为蜡样芽孢杆菌SHS-0903,提取此菌种壳聚糖酶基因,连接到原核表达载体pET28a上,以大肠杆菌BL21为宿主转化表达,获得了工程菌,并对其发酵产酶条件进行优化,研究确定其最适产酶培养基。在此培养条件下,经过破壁离心后的壳聚糖酶活力可达到1500U/m L。发酵粗酶液经离心,20%-70%硫酸铵盐析后经浓缩得到壳聚糖精酶。酶学性质研究表明,其酶解最适温度为55℃,最适pH在4.8,该酶在60℃以下稳定,4℃冷藏30天后酶活保持在90%以上。Mn2+对酶活有促进作用,Cu2+,Fe3+对酶活有抑制作用。该壳聚糖酶为专一性内切酶,此酶的比活性比己知的壳聚糖酶酶活都要高,应用此酶使得酶法生产壳寡糖实现工业化生产成为可能。研究了壳寡糖的酶法生产条件,分别考察了酶促反应中温度,pH,底物浓度,酶用量,反应时间的影响。结果表明在pH4.8-5.3,壳聚糖浓度6.5%,壳聚糖酶加入量10U/g的条件下,反应温度53-57℃,酶解反应时间为100min,经离心浓缩喷雾后得到壳寡糖。检测了其部分质量标准。具体如下:外观:淡黄色粉末,pH5.74,水不溶物:0.015%,水分:10.1%,灰分:1.7%,色度:5800,平均分子质量:1920,得率为97.2%。
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