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枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的重组表达质粒不太稳定等因素影响，其应用受到一定的限制。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。本文旨在建立一套枯草杆菌高效表达和分泌系统，实现甲基对硫磷水解酶基因mpd在枯草杆菌中的高效表达和分泌，以解决其在原始菌株中表达存在的一些问题；同时本文亦对枯草杆菌同源重组和载体转化等遗传操作体系进行了一些探索性研究。 以mpd基因为报告基因，构建了一个新型的方便而高效的启动子探针pUC-mpd。构建了枯草杆菌168的基因组DNA的启动子文库，利用启动子探针从文库中克隆了一系列启动子功能片段并比较了其在大肠杆菌中的启动子强度，得到了两个克隆有强启动子片段的克隆pMPDP3和pMPDP29。测定并分析了重组载体pMPDP3和pMPDP29克隆到的两个强启动子功能片段的序列，分别为两个功能未知基因ytkA和ywoF基因上游的启动子，mpd基因分别与ytkA和ywoF基因的信号肽编码序列发生了融合表达。对两个启动子的结构及两个基因与MPH的融合表达产物进行了预测和分析。ytkA基因表达产物的信号肽为脂蛋白信号肽，而ywoF基因表达产物的信号肽为分泌型信号肽。 利用大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pNW33N与mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。利用该探针钓取启动子后可以不经亚克隆而直接转入枯草杆菌测定和比较启动子的强弱。利用穿梭启动子探针重新克隆了ytkA和ywoF基因的启动子与信号肽编码序列，构建了mpd基因穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将载体pNYTM和pNYWM转入枯草杆菌1A751重组表达mpd基因。发现在枯草杆菌中，ytkA基因的启动子强度远强于ywoF基因的启动子。1A751（pNYTM）的mpd重组表达产物与细胞结合，而1A751（pNYWM）的mpd重组表达产物大部分分泌在发酵液上清中。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽重新构建了mpd基因的分泌表达载体pYNMK。将pYNMK转入缺失了8种蛋白酶的枯草杆菌WB800，使mpd基因获得了更高水平的分泌表达，91.4％的酶分泌在上清液中，表达量是出发菌株的10.8倍。 进而利用PCR方法克隆和融合了P43启动子功能片段和nprB基因信号肽编码序列，构建了新的大肠杆菌-枯草杆菌分泌表达载体pP43NMK。将pP43NMK导入到枯