第一部分低剂量糖皮质激素对不同程度肾损伤的慢性马兜铃酸肾病患者病情进展的影响及可能机制背景与目的马兜铃酸肾病(Aristolochic acid nephropathy, AAN)是马兜铃类中草药引起的肾小管间质疾病。我国AAN以慢性最为多见,其病理损害大多数表现为肾间质纤维化。大量研究表明,各种肾间质纤维化均可能有炎症参与或有免疫因素参与。迄今为止,对慢性AAN尚无成熟的治疗方案。近年来,国内外已有少量关于糖皮质激素治疗慢性AAN的报告,提示糖皮质激素对延缓AAN进展有一定疗效。本研究应用低剂量糖皮质激素对伴有轻中度及重度肾功能不全的慢性AAN患者进行治疗,重点观察该治疗对慢性AAN的病程有无有益作用。方法选择北京协和医院肾内科1998年11月～2010年4月临床诊断慢性AAN患者共79例进入本研究。根据治疗前血清肌酐水平分为轻中度肾功能不全组(血肌酐<354μmol/l,42例)和重度肾功能不全组(血肌酐≥354μmol/l,37例)。轻中度肾功能不全组AAN患者分为激素治疗组(n=18)与对照组(n=24),两组患者在性别分布(P=0.839)、年龄(P=0.39)、治疗前各项血生化指标、血红蛋白及血压等方面均无显著差异。重度肾功能不全组AAN患者分为激素治疗组(n=23)与对照组(n=14),两组在性别分布(P=0.353)、年龄(P=0.262)、治疗前各项血生化指标、血红蛋白及血压等方面均无显著差异。对轻中度肾功能不全患者随诊观察2年,重度肾功能不全患者随诊观察1年。分别对两组患者的血清肌酐值进行自身前后和组间比较,以评价激素治疗对肾功能不全的慢性AAN患者的病程进展有无影响；同时对接受糖皮质激素治疗的轻中度与重度肾功能不全患者的临床转归进行比较分析,以评价不同程度肾功能不全的AAN患者从激素治疗中的获益有无差别。结果轻中度肾功能不全的AAN患者,激素治疗组在2年随访时间内血肌酐基本维持稳定,与治疗前比较无显著差异(P>0.05)；对照组患者在随诊中血肌酐缓慢进行性升高,在9-24月的各时间点与治疗前比较均有统计学差异(P<0.05)。轻中度肾功能不全的AAN患者中激素治疗组与对照组两组间比较,在9-24月的各时间点,激素治疗组的血清肌酐均显著低于对照组(P<0.05)。重度肾功能不全的AAN患者,激素治疗组血肌酐在6月内逐步下降,与初始比较有明显统计学差异；9月、12月血肌酐值略有回升,与治疗前相比无明显差异。而对照组患者血肌酐持续缓慢升高,6月、9月、12月时与初始比较均有明显统计学差异。重度肾功能不全的AAN患者中激素治疗组与对照组两组间比较,在6-12月的各时间点,激素治疗组的血清肌酐均显著低于对照组(P<0.05)接受糖皮质激素治疗的患者,重度肾功能不全组与轻中度肾功能不全组比较,两组患者在总随访时间内治疗有效率无明显差异。所有患者在随诊过程中血生化指标、血压、血红蛋白等均无明显变化。激素治疗组患者,尿转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1和单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein, MCP)-1明显下降。治疗过程中的不良反应轻微,仅部分患者出现类固醇糖尿病和带状疱疹病毒感染,2例高龄患者发生股骨头坏死。结论低剂量糖皮质激素能逆转或延缓轻中度及重度肾功能不全的慢性AAN患者病情进展,该种保护作用在治疗后3个月内即出现,至少可维持1-2年；低剂量糖皮质激素安全性较好,多数患者可耐受；糖皮质激素可降低尿TGF-β1和MCP-1的水平,可能是其治疗慢性AAN的作用机制之一。第二部分马兜铃酸肾病合并范可尼综合征患者临床及生化特点分析背景与目的小剂量马兜铃酸(Aristolochic acid,AA)作用于肾小管上皮细胞,可使该细胞变性、萎缩,出现肾小管功能障碍型AAN,主要表现为肾小管酸中毒和/或Fanconi综合征(Fanconi syndrome, FS)。目前国内外已有少量关于AAN伴Fanconi综合征的个案报道,尚未见大宗临床观察。目前漏诊、误诊仍常有发生,为了提高临床医生对AAN合并Fanconi综合征患者的认识,本研究对AAN合并Fanconi综合征患者的临床表现及生化特点进行分析。方法回顾性分析1998年11月～2010年9月北京协和医院肾内科诊断AAN合并Fanconi综合征患者38例(初始血肌酐≤354μmol/1),男性10例,女性28例,平均年龄为55.81±14.14岁。根据是否应用激素治疗分为一般治疗组(n=10)和激素治疗组(n=28)。对所有患者随诊观察1年,主要观察患者的临床表现、血生化指标、血气分析指标、尿糖、尿氨基酸定性、尿β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)等指标以及治疗反应。结果患者临床症状以乏力(68.42%)、恶心纳差(42.11%)、夜尿增多(15.79%)和腰背痛(21.05%)为主要表现,部分患者有明显多饮多尿(26.32%),表现为骨痛、手足抽搐及泌尿系感染者均占5.26%。所有患者均有明显高氯性代谢性酸中毒,3例患者行碳酸氢根重吸收排泄试验给予了证实。患者有明显物质转运障碍,包括低磷血症17例(44.74%)、低尿酸血症12例(31.58%)、肾性糖尿(100%)、氨基酸尿(72.2%)和低分子量蛋白尿(24小时尿蛋白1.06±0.58g),尿β2-MG明显升高(2855.12±3488.98ng/1)。4例患者接受肾活检,结果显示有明显小管-间质病变。随访过程中,对照组患者大多数进入透析,尿糖持续存在。糖皮质激素治疗组大多数患者肾功能维持稳定,尿氨基酸转阴,部分患者尿糖消失。所有患者12月时尿β2-MG明显降低(879.08±694.19ng/1),血尿酸、血磷有所恢复,分别为273.30±81.27μmol/l和1.15±0.23mmol/l,和初始相比均有明显统计学意义(P<0.05)。结论马兜铃酸肾病可合并Fanconi综合征,完善相关检查可明确诊断；糖皮质激素对AAN继发的范可尼综合征有一定疗效。第三部分地塞米松对马兜铃酸诱导HKC细胞上皮-间充质转化(EMT)的作用背景与目的肾小管上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)在肾间质纤维化的发生、发展中起重要作用。马兜铃酸可诱导肾小管上皮细胞发生EMT转变为肌成纤维细胞,还可能通过细胞间“交叉对话”(如释放细胞因子等)作用于间质成纤维细胞,激活后者合成及分泌大量细胞外基质,致使肾间质纤维化。近年来,有报道应用糖皮质激素治疗马兜铃酸肾病,但其机制尚不十分清楚。本部分的研究目的是探讨地塞米松(Dexamethasone, Dex)对AA诱导人肾小管上皮细胞(HKC)发生EMT的作用。方法实验一实验分组为：(1)正常对照组；(2)AA刺激组(10μg/ml); (3)地塞米松作用组(100μmol/l); (4) AA (10μg/ml)+无水乙醇(100μmol/l)组：(5)AA (10μg/ml)+不同剂量的地塞米松(100、10、1、0.1、0.01μmol/l)共同处理48小时。应用激光共聚焦方法检测HKC细胞α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙粘素(E-cadherin)的表达,Real-time PCR、Western Blot方法检测α-SMA、E-钙粘素的表达强度,ELISA法检测培养上清液中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原(collagen I,COLⅠ)的表达。实验二实验分组为：(1)正常对照组；(2)AA刺激组(10μg/ml);(3)地塞米松作用组(100μmol/l); (4) AA(10μg/ml)+地塞米松(100μmol/l)共同处理0、6、12、24、48小时。Real-time PCR、Western Blot方法检测a-SMA、E-钙粘素的表达强度,ELISA法检测培养上清液中FN、COL I的表达。所有实验均重复3次结果1.激光共聚焦显微镜观察发现,作用48小时,与阴性对照组比较,AA作用组和AA+无水乙醇组E-钙粘素表达明显减弱,a-SMA表达明显增强,单独Dex作用组与阴性对照组相比无明显变化。同AA作用组相比,Dex(100μmol/l)与AA共同作用组,α-SMA表达明显减弱而E-钙粘素表达明显增加。随Dex浓度下降,α-SMA表达逐渐增加而E-钙粘素表达逐渐减弱。2. Real-time PCR、Western Blot和ELISA结果显示,AA作用48小时后,HKC细胞a-SMA表达较阴性对照组显著升高,E-钙粘素表达显著降低,培养液上清中FN、COL I明显升高(P<0.05),而单独Dex作用组和阴性对照组相比无明显变化。与AA单独作用组相比,Dex (100μmol/l)与AA共同作用组α-SMA表达明显降低,E-钙粘素表达显著升高,随着与AA共同作用的Dex浓度下降,α-SMA表达和培养液上清中FN、COL I的水平逐渐升高,E-钙粘素表达逐渐降低(P<0.05)。3. Real-time PCR、Western Blot和ELISA结果显示,48小时内,随作用时间延长,AA组a-SMA和培养液上清中FN、COL I的水平逐渐增加,E-钙粘素表达逐渐减低,与对照组相比,在24和48小时有明显统计学差异(P<0.05)。AA+Dex组a-SMA和培养液上清中FN、COL I的水平在48小时内逐渐下降,而E-钙粘素的表达在48小时内无明显降低,和单独AA刺激组相比,48小时有明显差异(P<0.05)。结论AA能诱导体外培养的HKC细胞发生EMT,Dex能呈浓度依赖性地抑制AA诱导HKC细胞发生EMT,主要发生于Dex干预后24和48小时。第四部分地塞米松抑制马兜铃酸诱导HKC细胞EMT过程中Smad信号途径表达的变化背景与目的有研究表明,在慢性马兜铃酸刺激导致的EMT和间质纤维化过程中,TGF-β1/Smad信号途径起主要作用；该途径中起关键作用的是Smad3,在Smad3基因敲除的实验动物中,肾组织无明显EMT发生。近年来,已有少量关于糖皮质激素治疗慢性AAN的报告,研究发现激素治疗对AAN模型大鼠的肾间质纤维化有一定程度的减轻。同时相关学科领域研究发现,在支气管上皮细胞发生EMT过程中,给予地塞米松可减少α-SMA、Ⅰ型胶原和粘蛋白C的表达；在成骨细胞中,应用地塞米松可抑制Smad3途径的激活。本部分的研究目的是探讨Dex抑制AA诱导HKC细胞发生EMT的过程中对TGF-β1/Smad信号途径的影响。方法实验一实验分组为：(1)正常对照组；(2)AA刺激组(10μg/ml);(3)地塞米松作用组(100μmol/l);(4)AA(10μg/ml)+无水乙醇(100pmol/l)组：(5)AA (10μg/ml)+不同剂量的地塞米松(100、10、1、0.1、0.01μmol/l)共同处理48小时。实时荧光定量PCR方法检测HKC细胞的Smad7和TGF-β1 mRNA的表达,Western Blot方法检测HKC细胞的TGF-β1、p-Smad3、Smad3和Smad7蛋白的表达。实验二实验分组为：(1)正常对照组；(2)AA刺激组(10μg/ml)；(3)地塞米松作用组(100μmol/l);(4) AA(10μg/ml)+地塞米松(100μmol/l)共同处理0、6、12、24、48小时。实时荧光定量PCR方法检测HKC细胞的Smad7和TGF-β1 mRNA的表达,Western Blot方法检测HKC细胞的TGF-β1、p-Smad3、Smad3和Smad7蛋白的表达。结果1.和阴性对照组相比,AA刺激组HKC细胞TGF-β1 mRNA表达、p-Smad3和TGF-β1蛋白表达水平均显著增高,Smad7 mRNA和蛋白表达水平显著下降；Dex单独作用组以上各指标均无明显变化。而AA+Dex组,不同浓度Dex干预后HKC细胞TGF-β1 mRNA、p-Smad3和TGF-β1蛋白表达水平呈下降趋势,Smad7 mRN A和蛋白表达水平均逐渐升高,其中较高浓度的Dex处理组最显著。2.48小时内,随作用时间延长,AA刺激组TGF-β1 mRNA、p-Smad3和TGF-β1的蛋白表达水平均逐渐增加,Smad7 mRNA和蛋白表达逐渐下降,以24和48小时最明显,和阴性对照组相比均有明显统计学差异(P<0.05)。而AA+Dex组TGF-β1mRNA和蛋白表达、p-Smad3蛋白表达在48小时内均无明显升高,Smad7 mRNA和蛋白表达水平无明显降低,和单独AA刺激组比较,24和48小时有明显差异(P<0.05)。结论Dex可抑制AA诱导的HKC细胞发生EMT,其机制可能与下调EMT过程中TGF-β1和p-Smad3、上调Smad7分子的表达有关,提示TGF-β1/Smad通路可能是Dex抑制EMT发生的机制之一。