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β-香树脂醇是一种五环三萜化合物,也是其它齐墩果烷型三萜,如甘草次酸、大豆皂甙等生物合成的骨架,具有抗炎、抗菌、抗病毒等良好的药学特性。通过代谢工程与合成生物学的方法已在酿酒酵母中成功实现了β-香树脂醇的合成,但由于前体物供应不足、有毒中间代谢产物的积累及反馈调节等因素导致产量较低,大大限制了其规模化生产和广泛应用。针对酿酒酵母合成β-香树脂醇中重要起始前体物乙酰辅酶A的供应问题,本研究采用代谢工程策略,强化细胞质乙酰辅酶A供应,同时过表达3-羟-3-甲基-戊二酰辅酶还原酶和合成β-香树脂醇所涉及的ERG系列基因以提高鲨烯合成,从而达到β-香树脂醇在酿酒酵母体内的高效合成。研究结果如下:(1)在增加酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A含量提高终产物β-香树脂醇产量方面,主要从强化酿酒酵母内源乙酰辅酶A途径和构建外源乙酰辅酶A途径两方面入手。强化酿酒酵母内源乙酰辅酶A途径包括:(1)采用质粒表达方式,过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因ADH2,使乙醇更多地流向乙酰辅酶A合成途径,以用于终产物β-香树脂醇合成,单位细胞β-香树脂醇产量达3.97mg/g,为出发菌株的1.52倍;(2)在酿酒酵母基因组HO位点过表达乙醛脱氢酶基因和乙酰辅酶A合酶基因ACS1和ACS2,强化细胞质丙酮酸脱氢酶支路,β-香树脂醇产量分别达到30.4和31.24mg/L,分别为出发菌株的1.3倍和1.34倍。但以1分子葡萄糖为底物,通过丙酮酸脱氢酶支路合成2分子乙酰辅酶A,净消耗2分子ATP,影响了以乙酰辅酶A为前体的β-香树脂醇的生产效率;由于酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A合成途径需要消耗较多的ATP,导致乙酰辅酶A合成效率低,为了减少或消除细胞质乙酰辅酶A合成的ATP消耗,研究者开始在酿酒酵母中引入外源乙酰辅酶A合成途径。在酿酒酵母基因组构建的外源乙酰辅酶A合成途径包括:(1)通过引入丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰转乙酰基酶和二轻硫辛酸脱氢酶三个外源基因,在酿酒酵母中成功构建丙酮酸脱氢酶途径,结合敲除戊糖磷酸途径(主要生成NAPDH)的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,使NADP~+更多地被丙酮酸脱氢复合体利用,有效提高了β-香树脂醇的产量,达到33.2mg/L,为出发菌株的1.49倍;(2)通过引入构巢曲霉密码子优化的柠檬酸裂解酶基因,在酿酒酵母中成功构建柠檬酸裂解酶途径,直接催化细胞质柠檬酸合成乙酰辅酶A。外源补加柠檬酸,有效提高了β-香树脂醇的产量,达到31.05mg/L,为出发菌株的1.53倍;(3)通过引入分别来自大肠杆菌、肠膜明串珠菌和克氏梭菌的乙酰乙醛脱氢酶、木酮糖特异性磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶,在酿酒酵母中成功构建了两条异源乙酰辅酶A合成途径,并通过表达来自玫瑰杆菌属细菌消耗NADH的和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶提升了途径的NADH平衡,结果有效提高了β-香树脂醇的产量,达到39.49mg/L,为出发菌株的1.95倍。结合进一步敲除柠檬酸合酶以阻止细胞质乙酰辅酶A流失,进一步提高了β-香树脂醇产量,达到69.64mg/L,为出发菌株的3.34倍;(2)强化鲨烯合成方面:过表达甲羟戊酸途径的限速酶基因t HMG1强化鲨烯合成,单位细胞β香树脂醇产量达4.19mg/g,为出发菌株的1.7倍;最后,同时过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶ADH2和t HMG1有效提高了β-香树脂醇的产量,达到32.01mg/L,为出发菌株的1.37倍;(3)发酵优化方面,将高产β-香树脂醇的菌株BA40进行葡萄糖补料发酵,β-香树脂醇产量达到272.42mg/L,为摇瓶发酵的3.91倍,为目前报道的运用酿酒酵母合成β-香树脂醇的最高产量。