麦胚酶解产物对氧化损伤细胞的保护作用及相关肽的鉴定

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小麦胚芽作为面粉加工的副产物,是一种潜在的植物蛋白资源,目前国内外对脱脂麦胚蛋白的开发主要集中在营养源水平上,而在生理活性水平上的研究成果不多。本研究旨在探讨脱脂麦胚酶解产物(wheat germ protein isolate hydrolysates,WGPIH)对氧化应激细胞的生物学作用,进而为合理并有效开发麦胚蛋白提供科学理论依据。首先,对比分析了不同酶解时间所得WGPIH的抗氧化活性。在三种体外抗氧化模型中,WGPIH1WGPIH5的抗氧化活性均呈现剂量效应。WGPIH5(酶解时间为240min)表现最强的抗氧化活性,能够明显抑制亚油酸脂质过氧化;Fe2+螯合能力的IC50为0.37±0.05mg/mL;当质量浓度为5mg/mL时,TEAC值可达0.81±0.01mmol/L Trolox。在此基础上,采用H2O2诱导PC12氧化损伤模型研究了其抗氧化活性,结果表明,200μmol/L H2O2可使PC12细胞存活率降至50%左右,当酶解产物的浓度为1mg/mL时,经WGPIH1WGPIH5保护的PC12细胞的细胞存活率呈现依次升高的趋势。1mg/mLWGPIH5可使细胞存活率提高32.85%,使细胞LDH释放率减少4.33%。其次,测定了WGPIH5的氨基酸组成和相对分子质量分布。WGPIH5含有30.17%的必需氨基酸,且疏水性氨基酸含量较高;WGPIH5的相对分子质量集中在3000Da以下,其中2000180Da的比例占86.72%。再次,研究分析了WGPIH5对H2O2诱导PC12氧化损伤细胞模型的抗氧化机理。倒置显微镜观察WGPIH5能明显减少受损细胞数目,维持细胞原有椭圆或梭状形态,减轻细胞核固缩和DNA片段化;扫描电镜观察WGPIH5能保护胞质,维持细胞表面微绒毛结构,减少凋亡小体的出现。采用试剂盒检测胞内抗氧化酶促体系的活性和脂质过氧化产物的含量,实验结果表明,WGPIH5可显著提高PC12细胞胞内SOD和CAT活性水平(P<0.05),降低MDA的生成(P<0.01)。应用流式细胞技术检测细胞周期、细胞凋亡率、胞内Ca2+浓度及线粒体跨膜电位,发现1mg/mLWGPIH5可调控细胞各周期的比例,使Sub-G1峰所占比例下降8.10%;可减少细胞凋亡,使细胞凋亡率降低11.20%;可稳定胞内Ca2+浓度水平,使胞内Ca2+浓度下降32%,并可阻止线粒体膜电位的下降。最后,利用大孔吸附树脂对WGPIH5进行脱盐及初步分级,采用15%75%乙醇进行洗脱,分析各组分对H2O2诱导PC12氧化损伤模型的影响。发现35%乙醇洗脱组分WGPIH5-b的抗氧化能力最强,1mg/mL WGPIH5-b可使细胞存活率提高33.51%,同时,脱盐率可达90.23%。利用凝胶过滤层析对WGPIH5-b进行进一步分离纯化,得到五个组分,其中WGPIH5-b2能够显著提高H2O2诱导PC12氧化损伤模型细胞存活率,1mg/mLWGPIH5-b2可使细胞存活率提高34.43%。采用MALDI TOF/TOF对WGPIH5-b2进行肽序列分析。质谱技术测得WGPIH5-b2主要由1221Da和2168Da的两个肽段组成,串联质谱得出:1221Da肽段的一级序列为His-Trp-Pro-Leu-His-Lys-Val-His-Ala-Pro(简称为HWPLHKVHAP);2168Da肽段的一级序列为Pro-Lys-Lys-Ser-Asp-Arg-Cys-Phe-Thr-Leu-Asp-Lys-Cys-Ala-His-Thr-Tyr-Asn(简称为PKKSDRCFTLRKCAHTYN)。
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