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背景乙型肝炎病毒(Hepqtitis B virus, HBV)感染是一种严重危害人类健康的疾病。乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)是乙型肝炎诊断及治疗评估中非常重要的血清学标志物。在HBV感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等情况下,人体内会出现低浓度的HBsAg[1]。HBsAg浓度低的患者可能存在着肝脏的持续性损伤和病毒复制[2],如果漏检,可能影响患者的及时治疗,或者导致HBV通过手术、输血等途径传播。对低浓度血清HBsAg进行有效检测,具有重要的临床和流行病学意义[3]。目前检测低浓度HBsAg灵敏度较高的方法是化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CLIA),但由于需要大型仪器,基层医院很难普及,检测费用也比较高,大多数患者难以承受,有一定的局限性。酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay,ELISA)检测HBsAg具有简单、方便、快速的优点,但灵敏度不高,在HBsAg浓度比较低的情况下,经常会出现弱阳性或假阴性结果。如何比较有效和经济的提高ELISA检测HBsAg的灵敏度是当前研究的重点。本课题建立基于磁珠为介质的浓缩方法(磁珠浓缩法),分析磁珠浓缩方法的特点,用于提高ELISA检测低浓度HBsAg的灵敏度与阳性检出率。结果将阐明磁珠吸附蛋白质的机理,使磁珠提取蛋白在更多的蛋白质上进行推广发挥作用;寻找合理的吸附纯HBsAg与血清HBsAg的实验条件,为磁珠在吸附与分离临床上其它蛋白质的运用提供借鉴;阐明磁珠浓缩HBsAg的作用,为临床提高ELISA检测低浓度HBsAg灵敏度提供有效的浓缩方法,使磁珠浓缩方法在临床上推广。目的1.通过研究羧基磁珠吸附纯HBsAg和血清中HBsAg的性能,确定磁珠浓缩血清HBsAg的方法。与其它蛋白浓缩方法(高速离心、聚乙二醇透析、聚丙烯凝胶颗粒吸附、真空抽干)比较,分析磁珠浓缩法的特点。2.确定磁珠浓缩法所能达到的最低检出限,探讨磁珠浓缩法在提高检测低浓度HBsAg灵敏度与阳性检出率中的意义。磁珠浓缩HBeAg与HBVDNA阳性的血清标本,探讨磁珠浓缩方法在乙型肝炎其它检测项目中的应用价值。方法1. BCA蛋白检测法检测磁珠吸附血源性HBsAg纯品前后的蛋白量,改变磁珠用量、吸附时间、吸附温度等条件,探讨磁珠吸附HBsAg的性能;ELISA试剂盒检测磁珠吸附血清HBsAg前后的吸光度值,改变磁珠用量、血清pH值、吸附温度、吸附时间、PBS的pH值、洗脱液的种类与浓度等条件,建立最佳的磁珠浓缩血清HBsAg的实验条件。2.分别使用磁珠浓缩法、高速离心、聚乙二醇透析、聚丙烯凝胶颗粒吸附、真空抽干浓缩处理血清标本,比较浓缩前后ELISA检测的HBsAg的结果,并比较五种浓缩方法的差异,分析磁珠浓缩法的优越性与可行性。3.标定HBsAg阳性临床血清,判断磁珠浓缩后ELISA检测HBsAg的最低检出限;磁珠浓缩HBsAg阴性、不同稀释液稀释HBsAg阳性血清、低浓度HBsAg血清后,判断磁珠是否会出现假阳性、是否受到其它微生物影响、是否能提高低浓度HBsAg的阳性检出率。4. SDS-PAGE法电泳磁珠浓缩乙肝大三阳血清后的洗脱液,判断磁珠吸附蛋白的特异性;ELISA法和实时荧光定量PCR法分别检测磁珠浓缩前后HBeAg和HBVDNA的结果,判断磁珠是否对HBeAg和HBVDNA的检测也具有浓缩作用。结果1.磁珠吸附HBsAg的能力受HBsAg的浓度、温度、磁珠用量、温育时间的影响。吸附上的纯HBsAg,使用10mMNaOH洗脱后,洗脱率是71.02%,生物活性保留率为88.15%。磁珠吸附血清中HBsAg的能力受磁珠用量、温度、吸附时间、血清与PBS的pH值、洗脱液的种类与浓度等因素影响。2.磁珠浓缩法、高速离心、聚乙二醇透析、聚丙烯酰胺凝胶颗粒吸附、真空抽干浓缩血清标本后的S/CO值均高于浓缩前(P<0.01)。任何两种浓缩方法都有明显的差异(P<0.01),浓缩水平由高至低依次为:冷冻干燥、磁珠吸附法、高速离心、聚乙二醇透析法、聚丙烯酰胺凝胶吸附法。3.磁珠浓缩后ELISA检测HBsAg的最低检出限是0.1IU/ml,灵敏度高于浓缩前(最低检出限为0.6IU/ml),浓缩后S/CO值与HBsAg浓度的线性相关系数(r)为0.998,略高于浓缩前(r=0.990)。并没有增加HBsAg阴性血清的S/CO值(P>0.05);阴性血清、HCV阳性血清、梅毒阳性血清稀释HBsAg阳性标本,浓缩前后的S/CO值无差异(P>0.05); HBsAg弱阳性标本经过磁珠浓缩后,阳性检出率为82.1%,与浓缩前比较,差异有统计学意义(χ2=17.765,P<0.01)。4.洗脱液进行电泳后,条带比较复杂,除了有与HBsAg纯品一致的条带,还有其它的杂带;磁珠浓缩后HBeAg的S/CO值和HBVDNA的浓度均高于浓缩前(P<0.01)。结论1.成功建立磁珠浓缩方法,具有简单、快速、成本低廉等特点,但容易受磁珠用量、温度、吸附时间、pH值等多种因素影响。2.磁珠浓缩方法可以提高ELISA检测HBsAg的灵敏度,可以用于临床上提高低浓度HBsAg的检出率,对监测血清中低浓度HBsAg具有重要意义。3.磁珠浓缩方法与其它浓缩方法比较,具有简单、方便、快速的优点,很适合在临床与血站推广使用。4.磁珠浓缩方法浓缩蛋白是利用电子交换原理,具有非特异性,可以进一步在乙型肝炎其它检测项目或临床上其它蛋白中推广使用。