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目的:肺癌是癌症相关死亡的首要原因。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占80%左右,大多数NSCLC诊断时已经属于晚期,5年生存率不足15%。以铂类为基础的两药联合方案是晚期NSCLC的标准一线化疗方案,但是化疗有效率低、副作用大,近年来分子靶向治疗为晚期NSCLC提供了新的选择。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属于具有酪氨酸激酶活性的HER家族中的一员。HER家族包括四大成员:HER1or EGFR,HER2,HER3及HER4。EGFR与配体特异性结合,形成同源或异源二聚体,导致EGFR胞内区自动磷酸化及酪氨酸激酶激活,引起下游多条信号转导通路如Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt等激活,促进肿瘤细胞增殖、分化、迁移、侵袭等。目前发现,EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKIs)如吉非替尼、厄洛替尼等对带有EGFR基因敏感突变包括19外显子缺失突变、21外显子(L858R)替代突变的晚期NSCLC病人治疗有效,因此,EGFR-TKIs广泛用于晚期NSCLC的治疗,但大部分初始治疗有效的病人最终会出现耐药,提示可能存在其它分子影响EGFR信号通路,在NSCLC中发挥着重要作用。小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是细胞膜上Caveolae的重要组成蛋白,相对分子量21-24KDa,包括178个氨基酸残基,C端残基与N端残基游离,并且伸入胞质内,位于肽链中间的疏水性氨基酸残基(102-134)形成发卡样结构,将Cav-1锚定在细胞膜上。N端氨基酸残基为Cav-1的功能区,该区域与EGFR结合,从而参与肿瘤细胞增殖、粘附、迁移和信号转导。因此,推测Cav-1的表达可影响NSCLC对EGFR-TKIs的敏感性。本研究利用带有EGFR敏感突变的NSCLC细胞株PC-9,通过:(1)采用Western blot验证Cav-1过表达的稳定转染细胞株。(2)采用MTS比色分析法、划痕修复试验、Transwell法检测厄洛替尼对稳定转染细胞株增殖、迁移及侵袭能力的影响;(3)采用Western blot法,检测厄洛替尼对EGFR及下游信号通路中各激酶活化水平的影响。旨在探讨Cav-1的表达是否可影响NSCLC对EGFR-TKIs的敏感性。方法1 Western bolt验证Cav-1过表达的稳定转染细胞株利用Western bolt方法检测稳定转染细胞株中Cav-1蛋白水平。2 MTS比色分析法检测厄洛替尼对稳定转染细胞增殖能力的影响将PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1细胞分别接种于96孔板,次日换用含不同浓度厄洛替尼(0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32μmol/L)的完全1640培养液继续培养48h,加入MTS溶液,通过测定各孔的吸光度(OD)值,计算细胞生长抑制率和厄洛替尼的半数抑制浓度(IC50)。3划痕修复实验检测厄洛替尼对稳定转染细胞迁移能力的影响将PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1细胞分别接种于24孔板,24h后用10μl移液器吸头划痕,PBS洗去漂浮的细胞,两种细胞都分别于完全1640培养液及含浓度为0.04μmol/L厄洛替尼的完全1640培养液中继续培养,在倒置显微镜下观察并拍照,每6h拍照一次,直至划痕愈合,测量划痕宽度变化,计算细胞迁移率。迁移率=(划痕初始宽度-目前宽度)/2/划痕初始宽度×100%。4 Transwell法检测厄洛替尼对稳定转染细胞侵袭能力的影响铺基质胶于Transwell小室的上室,将PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1细胞分别接种于上室,两种细胞都分别于无胎牛血清的1640培养液及含浓度为0.04μmol/L厄洛替尼的无胎牛血清1640培养液中培养,下室放入含10%胎牛血清的1640培养液,继续培养48h后,95%冰乙醇固定,HE染色,显微镜下拍照,每个小室随机选取上、下、左、右及中心共5个视野,计算穿膜细胞数。5 Western blot检测厄洛替尼对稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的影响将PC-9/Cav-1及PC-9/pc DNA3.1细胞分别接种于35mm培养皿,予以浓度为0.04μmol/L厄洛替尼进行药物干预,分别于0h、4h后,收集细胞,提取总蛋白,Western blot检测p Y-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、Cav-1的蛋白水平,β-actin作为内参蛋白。结果:1稳定转染细胞Cav-1蛋白水平采用Western blot检测稳定转染细胞Cav-1蛋白水平,结果显示:PC-9/Cav-1细胞Cav-1蛋白的相对表达量(1.74±0.06)明显高于PC-9/pc DNA3.1细胞(0.61±0.99),差异有统计学意义。(P<0.05)2稳定转染细胞对厄洛替尼敏感性的变化2.1稳定转染细胞厄洛替尼的IC50MTS法检测厄洛替尼对稳定转染细胞增殖能力的影响,结果显示:给予不同浓度厄洛替尼作用的PC-9/Cav-1细胞的生长抑制率均低于相应浓度的PC-9/pc DNA3.1细胞,差异有统计学意义(P<0.05);PC-9/Cav-1组厄洛替尼的IC50值(0.06±0.01)明显高于PC-9/pc DNA3.1组(0.03±0.01),差异有统计学意义(P<0.05)。表明PC-9/Cav-1细胞对厄洛替尼的敏感性低于PC-9/pc DNA3.1细胞。2.2稳定转染细胞迁移能力的变化及对厄洛替尼作用的影响划痕修复实验检测细胞迁移能力的结果显示:在无厄洛替尼作用下,PC-9/Cav-1组细胞6h、12h、18h的迁移率(14.81±0.84%,27.98±0.73%,39.34±0.54%)均明显高于PC-9/pc DNA3.1组(12.89±0.81%,19.93±1.99%,26.07±0.68%),均有统计学意义(P<0.05);在0.04μmol/L厄洛替尼作用下,PC-9/Cav-1组细胞6h、12h、18h的迁移率(10.66±1.19%,14.61±2.23%,19.77±0.83%)明显高于PC-9/pc DNA3.1组细胞(4.80±1.04%,9.34±1.77%,14.14±2.61%),均有统计学意义(P<0.05)。2.3稳定转染细胞侵袭能力的变化及对厄洛替尼作用的影响Transwell法检测细胞侵袭能力的结果显示:在0μmol/L厄洛替尼作用下的PC-9/Cav-1组穿膜细胞数(79.00±4.60)明显多于PC-9/pc DNA3.1组(56.33±6.50),差异有统计学意义(P<0.05);在0.04μmol/L厄洛替尼作用下的PC-9/Cav-1组穿膜细胞数(49.00±3.60)明显多于PC-9/pc DNA3.1组(34.33±4.90),差异有统计学意义(P<0.05)。3厄洛替尼对稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的影响Western blot检测0μmol/L、0.04μmol/L厄洛替尼作用后稳定转染细胞中各蛋白的表达水平,经灰度扫描,结果显示:0μmol/L、0.04μmol/L厄洛替尼作用后,PC-9/Cav-1组p Y-EGFR的水平(2.25±0.29,2.01±0.13)均明显高于PC-9/pc DNA3.1组(1.54±0.09,1.02±0.05),均有统计学意义(P<0.05);PC-9/Cav-1组p-ERK的水平(2.24±0.05,0.80±0.15)均明显高于PC-9/pc DNA3.1组(1.36±0.02,0.28±0.02),均有统计学意义(P<0.05);PC-9/Cav-1组p-Akt的水平(0.83±0.02,0.64±0.01)明显高于PC-9/pc DNA3.1组(0.52±0.03,0.30±0.03),均有统计学意义(P<0.05)。结论:1 Cav-1减弱厄洛替尼对PC-9细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。2 Cav-1通过减弱厄洛替尼对PC-9细胞EGFR及下游Ras/Raf/MEK/ERK及PI3K/Akt信号转导通路激酶活化的抑制作用,降低厄洛替尼对PC-9细胞的敏感性。