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研究背景及目的缺血性下肢血管疾病以其高发病率和高致残率已成为威胁人类健康的重大疾病，促进血管的新生是目前治疗的方向之一。干细胞治疗是近年发展起来的热门领域，已用于越来越多的疾病治疗中，使用干细胞治疗促进血管新生逐渐受到人们的重视。然而，在众多研究中发现，干细胞在移植后由于缺血缺氧、免疫排斥等原因很难长期生存，直接影响其治疗效果。因此，促进干细胞在宿主体内的长期生存成为了直接影响干细胞治疗应用的主要瓶颈。Apelin是最早从牛胃的分泌物中提取的一种多肽，后经研究是一种脂肪细胞因子，为血管紧张素受体APJ的内源性配体。由于其广泛存在于人体各个器官，所以具有多重生物学效应。Apelin可有效增强心肌收缩力，扩张血管，降低血压，同时对血管内皮细胞、心肌细胞、干细胞具有保护作用。本实验结合分子影像学观察干细胞在移植部位的生存与转归，评估Apelin对于脂肪间充质干细胞的生存所起的保护作用，深入探讨Apelin促进脂肪间充质干细胞存活及功能发挥的保护机制，并通过在体分子影像为干细胞治疗在缺血疾病中的长期疗效和不良影响进行可靠评估。方法第一部分：Apelin对脂肪间充质干细胞在后肢缺血小鼠体内存活和功能的作用：实验共分五组：Sham+ADMSCs组、Sham+ADMSCs+Apelin组、ADMSCs组、Apelin组、ADMSCs+Apelin组。制备小鼠后肢缺血模型，各组分别于缺血后肢注射ADMSCs或ADMSCs+Apelin。激光多普勒扫描评估缺血后肢血流，免疫组织化学染色检测新生血管生成，自截肢率评价缺血程度，缺血损伤评分评价缺血损伤改善，活动损伤评分评价患肢功能改善。生物发光成像检测ADMSCs生存。化学发光法检测ADMSCs荧光素酶活性。组织学切片观察ADMSCs在组织内存活。第二部分：Apelin通过调节自噬促进缺氧复氧损伤下脂肪间充质干细胞的生存和功能：建立缺氧（H）4h/复氧（R）12h细胞模型。MTT法和生物发光成像（BLI）检测ADMSCs增殖。TUNEL染色检测ADMSCs凋亡。免疫荧光染色检测ADMSCs中自噬LC3Ⅱ表达。透射电子显微镜检测ADMSCs中自噬小体生成。制备小鼠后肢缺血模型，各组分别于缺血后肢注射ADMSCs+Apelin、ADMSCs+Apelin+CompoundC或ADMSCs+Apelin+LY294002。生物发光成像（BLI）检测ADMSCs生存。化学发光法检测ADMSCs荧光素酶活性。激光多普勒扫描评估缺血后肢血流，免疫组织化学染色检测新生血管生成，自截肢率评价缺血程度，缺血损伤评分评价缺血损伤改善，活动损伤评分评价患肢功能改善。第三部分Apelin通过调节自噬促进脂肪间充质干细胞生存的分子机制：建立缺氧（H）4h/复氧（R）12h细胞模型。Western blot法检测缺氧与缺氧复氧损伤阶段自噬信号通路蛋白的表达，检测Apelin对缺氧与缺氧复氧损伤阶段自噬信号通路蛋白的表达的影响，检测阻断AMPK和Akt后Apelin缺氧与缺氧复氧损伤阶段自噬信号通路蛋白的表达。结果1.激光多普勒扫描及组织学染色结果显示Apelin联合ADMSCs治疗可促进新生血管生成及缺血后肢血流的改善。自截肢率、缺血损伤评分、活动损伤评分结果显示Apelin联合ADMSCs治疗可促进患肢功能改善。生物发光成像及免疫荧光染色结果显示Apelin可促进后肢缺血模型中ADMSCs的生存。2. MTT及生物发光成像结果显示，在缺氧复氧条件下Apelin可促进ADMSCs的增殖。TUNEL染色结果显示，Apelin可抑制ADMSCs的凋亡。免疫荧光染色及透射电子显微镜检测结果显示，在缺氧条件下Apelin可促进ADMSCs的自噬，在复氧条件下Apelin可抑制ADMSCs的自噬。生物发光成像结果显示Apelin可通过抑制后肢缺血模型中ADMSCs的自噬促进其存活，从而改善血流恢复，促进功能改善。3.Western blot检测结果显示Apelin在缺氧阶段通过激活AMPK-mTOR-ULK1通路促进保护性自噬的发生，在复氧阶段通过激活Akt-Bcl2-beclin1通路抑制过度自噬的发生。结论Apelin可通过在缺氧阶段激活AMPK-mTOR-ULK1通路促进保护性自噬的发生，在复氧阶段通过激活Akt-Bcl2-beclin1通路抑制过度自噬的进一步发生调节自噬，促进脂肪间充质干细胞在体外缺氧复氧环境中及体内后肢缺血模型中的生存和功能，为干细胞治疗缺血性疾病提供新的辅助治疗靶点。