胃癌是一种起源于胃黏膜上皮的、较为常见的消化道恶性肿瘤,其死亡率在全球恶性肿瘤中居于第三位。依据我国近年来的胃癌死亡流行病学分析可知,胃癌在所有癌症中的死亡占比有所下调,且胃癌的死亡病例趋于年轻化。胃癌主要由幽门螺杆菌感染所引起。此外,遗传、年龄、环境、饮食及吸烟饮酒等因素都与胃癌的发生有关。胃癌的常规治疗措施,包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、分子靶向治疗、免疫治疗及中医药治疗等。近年来,虽然胃癌患者的治疗效果有所改善,但是胃癌的整体预后仍然非常差。中医药的运用有上千年历史,具有鲜明的中国特色。随着时代的进步,人们对疾病治疗的看法也随之改变,很多胃癌患者开始接受中西联合治疗。临床研究发现中医药在胃癌中有明显的治疗效果。鸦胆子,别名老鸦胆、苦参子,为苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实。鸦胆子被证实与青蒿素一样,具有明显的抗疟和抗肿瘤活性。鸦胆子素D是从鸦胆子中分离提取出来的一种苦木素类化合物。到目前为止,多个研究证实鸦胆子素D对慢性粒细胞白血病、肺癌、肝癌、胰腺癌和骨肉瘤等癌症的发生和发展均有不同程度的抑制作用。然而,鸦胆子素D对胃癌的影响尚未有相关报道。因此,本文主要是以鸦胆子素D为研究对象,在胃癌细胞及裸鼠异种移植模型中,研究鸦胆子素D调控胃癌细胞增殖及药物敏感性的分子机制。我们的主要研究结果如下:1.鸦胆子素D抑制胃癌细胞的细胞生长、增殖和成瘤能力首先,我们利用MTT实验对鸦胆子素D在胃癌细胞中的IC50值进行了检测,发现鸦胆子素D在HGC27、SGC7901和MKN45细胞中IC50分别为0.32μM、1.36μM和1.11μM。随后,我们利用MTT实验和BrdU荧光标记实验检测胃癌细胞增殖情况,结果显示鸦胆子素D对胃癌细胞的生长和增殖有明显的抑制作用,且呈时间和浓度依赖性。最后,我们利用软琼脂克隆形成实验和裸鼠异种皮下移植实验来检测鸦胆子素D对胃癌细胞体内外成瘤能力的影响,发现鸦胆子素D明显抑制胃癌细胞的增殖和成瘤能力。同时,我们对小鼠的肿瘤组织进行H&E和IHC染色,发现鸦胆子素D处理过后形成的肿瘤细胞数和细胞核大小明显要小于对照组。而且,鸦胆子素D处理过后,细胞增殖标志物Ki67的表达量也明显降低。因此,这些结果证实鸦胆子素D可明显抑制胃癌细胞生长、增殖及肿瘤形成能力。2.鸦胆子素D抑制胃癌细胞的细胞周期进程为了进一步的探究鸦胆子素D是如何来影响胃癌细胞的生长。我们利用流式细胞仪检测鸦胆子素D处理过后的胃癌细胞,结果显示胃癌细胞的细胞周期明显被阻滞在S期。同时,我们运用Western blot实验检测了 S期的相关周期蛋白的表达情况,结果显示CDK2、CyclinE1和CyclinE2等蛋白的表达明显下降,且呈时间和浓度依赖性。鸦胆子素D使胃癌细胞的细胞周期阻滞在S期,进一步的说明鸦胆子素D能调控胃癌细胞的细胞周期进程。3.鸦胆子素D增强胃癌细胞对阿霉素的化疗敏感性因为细胞容易对治疗药物产生耐药性,所以癌症治疗效果通常较为低下。阿霉素是治疗胃癌的常用化疗药物之一。因此,我们对鸦胆子素D能否增强胃癌细胞对阿霉素的化疗敏感性进行了研究。通过MTT实验,我们对鸦胆子素D与阿霉素的CI值进行了评价,结果显示HGC27和MKN45细胞系的CI值分别为0.693和0.525,这说明鸦胆子素D与阿霉素两者具有协同作用。然后,我们进行了细胞凋亡流式分析,结果显示鸦胆子素D和阿霉素联合处理后细胞凋亡明显强于鸦胆子素D或阿霉素单独处理。同时,我们进行了 Western blot蛋白检测实验,结果显示鸦胆子素D和阿霉素联合处理后,凋亡蛋白PARP和caspase-3的剪切体表达量显著增加。因此,我们推测鸦胆子素D可以增强胃癌细胞对阿霉素的化疗敏感性。4.鸦胆子素D通过LINC01667/miR-138-5p/CCNE1通路来调控胃癌细胞的增殖近年来,非编码RNA成为生物学领域一大研究热点,其在真核生物的基因表达调控过程中发挥重要作用。因此,我们从非编码RNA角度出发去探究鸦胆子素D调控胃癌细胞增殖的具体潜在机制。首先,我们对鸦胆子素D处理后的胃癌细胞进行了转录组测序。转录组测序结果显示鸦胆子素D处理后,细胞周期和mTOR信号通路发生明显变化,Western blot实验结果也进一步证实,鸦胆子素D处理后其相关蛋白的表达量均发生明显下调,且呈浓度和时间依赖性。随后,我们对转录组数据进行深入分析,结果发现鸦胆子素D处理后,LINC01667表达量显著降低。LINC01667本身在胃部组织几乎不表达,但其在胃癌细胞中高表达。这表明LINC01667在胃癌中可能起促癌作用。MTT和BrdU实验进一步证明,LINC01667可在一定程度上恢复鸦胆子素D处理后引起的细胞增殖抑制。之后,我们通过TargetScan数据库预测发现miR-138-5p可靶向结合LINC01667和CCNE1。qRT-PCR实验证明鸦胆子素D处理后miR-138-5p的表达量明显上调。双荧光素酶报告系统检测进一步证实LINC01667能够靶向结合miR-138-5p,而过表达LINC01667能够一定程度上恢复CCNE1的表达。结合上述实验结果,我们推测鸦胆子素D能够抑制LINC01667表达,而LINC01667则通过竞争性吸附miR-138-5p 调控 CCNE1 的表达。综上所述,鸦胆子素D能够通过LINC01667/miR-138-5p/CCNE1通路阻滞细胞周期进程,进而抑制胃癌细胞增殖。并且,鸦胆子素D还可增强胃癌细胞对阿霉素的化疗敏感性。因此,本研究证实鸦胆子素D对胃癌具有抑癌作用,为鸦胆子素D的临床应用提供了理论基础。