miRNA486靶向TIE1调控内皮祖细胞参与血管发生机制的初步探讨

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zygqqx
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目的:牵张成骨(distraction osteogenesis,DO)技术是在骨断端的两侧安置牵张器,通过缓慢牵张力实现血管、组织、新骨的再生,达到延长、修复骨组织的目的。miRNAs是由21-25个核苷酸组成的单链、内源性、非编码RNA分子,它们通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)中的互补位点进行碱基配对,负调控基因的表达。众所周知,血管的新生是新骨形成的前提和基础,而miRNAs在调节胚胎和出生后血管发育的结构和功能方面起着至关重要的作用,miRNA-486最近被鉴定为与红系相关的microRNA。故本研究旨在从体外探讨miRNA-486对EPCs生物学特性的影响,通过对miRNA-486靶基因的验证来说明miRNA-486是否通过靶向TIE1影响了EPCs的成血管分化,初步探讨miRNA-486对EPCs成血管信号通路活化的调控机制,为牵张成骨的治疗提供新的治疗靶点和理论依据。方法:1.EPCs的分离、培养、鉴定及miRNA-486对EPCs成血管作用的影响:密度梯度离心法分离培养犬EPCs,通过dil-fict双荧光染色实验对细胞进行鉴定;Matrigel成管实验、Transwell实验、流式细胞周期实验分别检测EPCs的成小管能力、迁移能力与增殖能力;构建过表达miRNA-486的慢病毒载体(LV-cfa-mir-486)和沉默miRNA-486的慢病毒载体(LV-cfa-mir-486-inhibition)分别转染EPCs,测定病毒感染的最佳MOI;RT-qPCR测定慢病毒转染EPCs的沉默和过表达效率;通过流式细胞周期实验、Transwell实验和Matrigel成小管实验,分别检测空白对照组(Control,CTRL)、空载慢病毒对照组(Negative Control,NC)和实验组(LV-mir-486or LV-mir-486-inhibitor)EPCs的增殖能力、迁移能力和成小管能力;通过RT-qPCR和Western blot分别检测各组成血管相关因子VEGF和bFGF的mRNA和蛋白的相对表达水平。2.miRNA-486靶基因TIE1的验证及miRNA-486对PI3K/Akt通路活化的影响:通过双荧光素酶报告基因检测实验对靶基因TIE1进行验证,RT-qPCR和Western blot分别检测各组的TIE1相对表达量进一步验证miRNA-486对基因TIE1的调控作用;通过Western blot检测miRNA-486下游PI3K/Akt信号通路关键因子PI3K和Akt的蛋白表达水平的影响。结果:1.密度梯度离心法分离培养的细胞呈集落样贴壁生长,细胞形态呈梭形、多角形或纺锤状;体外诱导培养的长梭形的EPCs之间相互连接形成数个中空的管状、网状;EPCs具有吞噬Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力而使细胞双染呈现红绿重合荧光;细胞迁移实验中穿过Transwell小室微孔膜下的细胞数量随着时间延长而增多;流式细胞周期实验中发现EPCs具有增殖和分化的潜能,具有干细胞特征;MOI为50时,慢病毒转染细胞72小时后感染效率可达80%左右且细胞生长情况良好;RT-qPCR检测慢病毒转染EPCs后miRNA-486沉默与过表达的效率较高,能满足后续实验需求;转染EPCs后的迁移实验中,过表达miRNA-486的EPCs穿过Transwell小室微孔膜下的数量较多,而沉默miRNA-486的EPCs迁移至Transwell下室的数量较少。转染EPCs后流式细胞周期实验中,过表达miRNA-486能促进EPCs进行DNA合成和细胞分裂,而沉默miRNA-486的表达会使细胞生长受抑制;Matrigel成小管实验中发现过表达miRNA-486的EPCs成小管结构较多,而沉默miRNA-486的EPCs成管腔结构数量较少。RT-qPCR和WB检测转染EPCs后成血管相关基因的表达结果显示,过表达miRNA-486会上调bFGF和VEGF的mRNA和蛋白水平,沉默miRNA-486会使bFGF和VEGF的mRNA和蛋白水平降低。2.双荧光素酶报告基因实验结果显示miRNA-486能与TIE1基因mRNA的3’UTR区靶位点发生特异性结合,抑制报告基因蛋白的生成。慢病毒转染EPCs后TIE1的RT-qPCR、Western blot检测结果显示过表达miRNA-486的EPCs中TIE1的mRNA相对表达水平与蛋白表达水平明显低于阴性对照,而下调了miRNA-486的EPCs中TIE1在转录水平和蛋白质翻译水平上与阴性对照组相比明显上升。Western blot检测转染EPCs后PI3K/Akt通路关键因子的蛋白质相对表达结果显示上调miRNA-486的表达后,PI3K和Akt表达水平升高,相反,下调miRNA-486表达的EPCs中PI3K和Akt表达水平受到抑制。结论:1.miRNA-486促进了EPCs的增殖、迁移、成管能力以及成血管相关基因VEGF和bFGF的表达,miRNA-486参与了EPCs成血管分化。2.miRNA-486能够靶向调控TIE1基因,参与PI3K/Akt信号通路的活化,从而促进EPCs体外增殖和成血管分化。
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