超斜照明量化位相显微镜研究与应用

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细胞内复杂的生物过程往往牵涉到很多亚细胞器、蛋白质以及分子等。利用电镜可以以纳米级的空间分辨率对细胞内的精细结构做详细的观察,超分辨率荧光显微技术的开发也为短时间内连续观察活细胞内细胞器的动态提供了强有力的手段。科学家们利用各类超分辨荧光显微技术观察到了细胞内很多重要的动态生物过程,可以说超分辨荧光显微技术为生物学家们打开了研究生命科学的新大门。但是,荧光标记在一定程度上会影响细胞的正常状态,并且荧光物质被激发时对细胞结构会产生光毒性和光漂白性,这对长时间连续观察细胞动态是不利的。特别地,目前荧光显微技术能同时观察的结构只有四到五个,对于同时观察多种细胞器、蛋白质或者分子结构还存在一定的困难。量化位相显微技术作为非荧光标记的成像方法为连续观察细胞内动态过程提供了新的手段。尽管量化位相显微技术在其空间分辨率、图像对比度以及时间分辨率等方面都有不少的进步,但细胞内大部分的精细结构以及快速的动态过程都还无法用非荧光标记的方法捕捉。针对这一现状,本论文提出了利用超斜照明实现对亚微米大小的细胞器的无标记观察。基于弱散射物体在斜照明下的光散射模型,本论文推导了部分相干斜照明成像系统的传递函数,系统研究了系统的分辨率与照明角度之间的关系。进一步,我们利用大数值孔径的物镜实现了样品的超斜照明,搭建了一个高空间分辨率、高时间分辨率并且图像对比度高的无标记量化位相显微系统。为了提高系统的成像速度,我们不仅在系统的硬件上进行了升级,包括使用照明强度比较大的发光二极管实现多角度的部分相干斜照明、切换速度极快的空间光调制器用于调制入射光的位相以及高灵敏度的相机用于信号的捕捉,同时,我们还先后开发了基于三张图的位相重建算法以及基于重复利用原始数据的交叉式重建算法,使系统的成像速度仅限于单次相机曝光时间上。在系统空间分辨率和图像对比度的测试中,我们分别对直径为200nm的聚苯乙烯小球和活细胞内的囊泡结构成像,测量结果显示超斜照明量化位相显微镜具有270nm的侧向空间分辨率以及很好的图像对比度。利用超斜照明量化位相显微镜,我们首次通过非荧光标记的方法捕捉到了活细胞内内质网网状结构以及囊泡沿着内质网运输的动态过程,说明系统具有很好的图像对比度以及空间分辨率。我们还在系统上增加了荧光通道,对有荧光标记的样品,如微球,线粒体和内质网等同时进行了荧光和位相的显微成像,验证了无标记显微技术对微米亚微米细胞结构测量的正确性。另外,为了验证系统具有高的时间分辨率,我们对内质网高速振动的动态过程进行了观察,结果显示在250帧每秒的成像速度下,系统成功地记录了内质网微管的高速振动过程。同时,我们首次用非荧光标记的成像方法捕捉到了线粒体的融合和分裂过程以及首次观察到线粒体特殊的自旋动态过程。综上所述,我们提出的非荧光标记显微成像方法为生命科学的进一步研究提供了新的手段。
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