【摘 要】
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骨髓间充质干细胞（MSCs）是潜在多能细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能,能够分化成骨、脂肪、软骨和肌肉等。了解MSCs成骨分化的过程和分子机制,有望为骨相关疾病提供新的治疗策略。近年来,有越来越多的数据表明Wnt信号通路能对MSCs具有调节成骨细胞分化的作用。本研究旨在进一步探讨Wnt7a基因在MSCs成骨细胞分化的作用机制。研究方法1.人MSCs分离和鉴定取人骨髓组织进行原代培养,用流式细胞
【基金项目】
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贵州省卫生计生委科学技术基金项目；
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骨髓间充质干细胞（MSCs）是潜在多能细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能,能够分化成骨、脂肪、软骨和肌肉等。了解MSCs成骨分化的过程和分子机制,有望为骨相关疾病提供新的治疗策略。近年来,有越来越多的数据表明Wnt信号通路能对MSCs具有调节成骨细胞分化的作用。本研究旨在进一步探讨Wnt7a基因在MSCs成骨细胞分化的作用机制。研究方法1.人MSCs分离和鉴定取人骨髓组织进行原代培养,用流式细胞仪检测其表面标志物CD44、CD90、CD105、CD34、CD45,并检测 Ki67 的表达。2.体外诱导分化和Wnt7a的表达成骨诱导分化后,用茜素红对细胞染色,荧光定量RT-PCR法检测成骨分化标志物（OCN、OPN）mRNA。用成脂诱导分化后,用油红染色对细胞染色,检测成脂肪分化标志物（PPARγ、LPL）mRNA。检测上述诱导分化后细胞的Wnt7a mRNA转录和蛋白表达情况。3.慢病毒体系沉默和过表达Wnt7a基因构建慢病毒沉默和过表达Wnt7a基因转染体系,分别进行成骨分化诱导。检测上述骨分化标志物以及RUNX2和OSX的转录和表达4.Wnt7a通过表达RUNX2调控MSCs骨分化诱导各组细胞成骨分化后,用荧光素酶检测RUNX2基因上游TCF1结合位点活性,染色质免疫共沉淀实验RUNX2和TCF1与Promoter的结合情况。研究结果1.人MSCs的分离和鉴定分离培养细胞与MSCs体形态相似,CD44表达率为98.34%,CD90为99.14%,CD105为99.97%,CD34和CD45分别为1.05%和0.08%,大部分细胞带有Ki67。2.人MSCs体外分化和Wnt7a的表达成骨分化后,有大量钙性沉积生成,OCN、OPN、Wnt7amRNA转录显著升高,Wnt7a蛋白表达量显著升高。成脂分化后,有大量脂肪生成,PPARGγ和LPL的mRNA显著升高,Wnt7a mRNA转录和蛋白表达显著下降。3.沉默和过表达Wnt7a基因对MSCs的影响对Wnt7a基因沉默后,Wnt7amRNA转录和蛋白表达显著下降。诱导成骨分化后,没有钙性结节生成,OCN、OPN、Wnt7a、RUNX2 mRNA转录和蛋白表达显著下降,OSX转录和表达下降不显著。对Wnt7a基因过表达后,Wnt7amRNA转录和蛋白表达显著升高。诱导成骨分化后,大量钙性结节生成,OCN、OPN、Wnt7a、RUNX2mRNA转录和蛋白表达显著升高,OSX转录和表达下降不显著。4.Wnt7a通过表达RUNX2调节MSCs骨分化沉默Wnt7a后,Wnt7a启动子的TCF1编码区与转录因子结合的活性以及结合的蛋白显著低于对照组（P<0.05）。而过表达Wnt7a基因后,其活性和蛋白远远高于对照组（P<0.05）。研究结论1.能运用组织块消化法对人MSCs进行体外分离培养并能传代培养。在诱导成骨分化后,Wnt7a基因的转录和表达大量升高,成脂分化后,则相反。2.沉默的Wnt7a基因会导致成骨分化受阻,而过表达Wnt7a基因会促进成骨分化,说明Wnt7a参与人MSCs成骨分化。3.Wnt7a基因通过活化RUNX2基因及其启动子上游TCF1发挥促进人MSCs成骨分化的作用。
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