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硒（Selenium,Se）是人和动物所必需的微量元素,在甲状腺激素代谢、防御氧化应激和炎症中发挥重要作用。硒主要是通过硒蛋白发挥生物学功能的,硒蛋白W（SelenoW）是硒蛋白家族中的重要成员之一,由于SelenoW具有CXXU基序和硫氧还原蛋白样折叠蛋白相似的β1-α1-β2结构,因此SelenoW被普遍认为具有氧化还原酶活性。SelenoW在各种组织中表达丰富,参与机体的骨骼肌发育、分化,以及各种细胞过程。目前,非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）被认为是全世界最常见的肝病类型之一,人类的发病率超过33%,已经成为主要的社会、经济和公共卫生领域中的主要问题。通过近期的研究发现,血清中硒含量过高会增加NAFLD的发病风险。而SelenoW在NAFLD发生中的角色及作用还未被阐明,值得深入研究。本试验构建了pc DNAFlag-Sleleno W重组质粒,通过免疫共沉淀（CO-IP）、串联质谱鉴定（LC-MS）、激光共聚焦显微镜和分子对接分析等方法,鉴定了SelenoW的互作蛋白。在构建野生型小鼠和SelenoW敲除小鼠高脂日粮性小鼠NAFLD模型,以及高糖/2DG刺激AML-12细胞模型的基础上,应用H&E染色、油红染色、透射电镜、转录组测序分析、免疫组化、TUNEL染色、流式细胞术、Hoechst染色、实时荧光定量PCR、免疫印迹试验和免疫荧光技术等方法,检测肝组织和细胞中糖酵解、细胞凋亡和脂肪代谢通路相关基因等的表达。本试验旨在探究SelenoW敲除靶向PKM2-HIF-1α信号调控小鼠高脂日粮性脂肪肝的作用机制。主要的研究结果如下:（1）肝脏超微结构及病理组织学结果显示,高脂日粮诱导野生型小鼠的肝脏组织内存在大量脂滴,细胞核皱缩,线粒体肿大,脂肪变性显著,肝索紊乱,细胞体积增大。而SelenoW敲除小鼠肝细胞内有少量脂滴,但是细胞核完整,仅有少量脂肪空泡存在于肝细胞中。通过油红染色能明显观察到,高脂日粮诱导的野生型小鼠肝脏内有大量被染色的甘油三酯（TG）,而SelenoW敲除小鼠中明显减少。可见,SelenoW敲除能够改善高脂日粮诱导的小鼠肝脏脂肪累积现象。（2）抗氧化水平检测结果显示,高脂日粮饲喂的野生型小鼠肝脏中的抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化能力（T-AOC）活性降低,而丙二醛（MDA）含量增加,而敲除SelenoW明显增加了抗氧化酶活性,降低了脂质过氧化物的含量,结果表明,SelenoW敲除能够降低高脂日粮（HFD）诱导的肝脏氧化应激。（3）转录组学分析结果显示,HFD日粮诱导下的野生型和SelenoW敲除小鼠中糖酵解代谢、细胞凋亡、HIF-1和PPAR通路差异显著。通过对差异通路的分析发现,糖酵解代谢中的PKM、FBP2、PFKP、PKM、ACSS1、PFKM、PCK2、LDHA、ALDOA、HK2、ENO3和PGAM2等基因,细胞凋亡通路中的BCL-2、Caspase 3和Casapse 9等基因,HIF-1通路中的HIF-1α,以及PPAR通路中FABP4和PPARγ等基因表达差异显著。结果表明,HIF-1α和FABP4基因可能参与Sleneo W敲除对HFD诱导的脂肪肝的保护机制。（4）CO-IP及LC-MS结果显示,SelenoW与PKM2存在相互作用关系。通过生物信息学分析发现,SelenoW的相互作用蛋白主要参与剪接体、内质网中的蛋白加工、碳代谢和糖酵解/糖异生信号通路。激光共定位和分子对接结果显示,SelenoW与PKM2在细胞质和细胞核中均有相互作用位点,方式为氢键结合。SelenoW敲除小鼠的肝脏中PKM2的m RNA和蛋白水平明显低于野生型小鼠。而细胞水平上,SelenoW过表达或敲低,显著增加或抑制了AML-12细胞中PKM2的表达。上述结果表明,SelenoW与PKM2存在靶向调控关系。（5）高脂日粮组野生型小鼠肝脏中糖酵解相关基因GLUT1、ENO3、ALDO和PFKFB3的m RNA表达明显增加,糖酵解关键限速酶LDHA、HK2、PFKM的m RNA和蛋白表达也均增加,SelenoW敲除小鼠肝脏中糖酵解相关基因和限速酶的表达低于野生型。在细胞水平上,敲低SelenoW能显著抑制PKM2的表达,反之过表达SelenoW能显著增加PKM2水平。结果表明,SelenoW敲除能够降低高脂日粮诱导的小鼠肝脏中的糖酵解代谢。（6）TUNEL染色结果显示,高脂日粮组野生型小鼠肝脏中细胞凋亡增加,而线粒体凋亡通路相关基因BAX、Cyt-C、Caspase 9和Caspase 3的表达升高,抗凋亡因子BCL-2的表达下降,而SelenoW敲除小鼠肝脏中细胞凋亡少于野生型,线粒体凋亡通路相关基因表达下降,抗凋亡因子表达上升。在高糖/2DG刺激的AML-12细胞模型中发现,SelenoW过表达明显升高细胞中的凋亡比例以及线粒体凋亡通路相关基因的表达,而2DG的加入起到显著的缓解作用。此外,高糖刺激下,HIF-1α抑制剂BAY87-2243能够缓解SelenoW过表达细胞中的凋亡比例,降低线粒体凋亡通路相关基因的表达。结果表明,SelenoW敲低通过调节PKM2-HIF-1α改善高脂日粮诱导的小鼠肝细胞凋亡。（7）高脂日粮组野生型小鼠肝脏中HIF-1α、脂肪酸转运酶FABP4、脂肪酸合成酶ACCα、FASN和ACLY的表达增加,脂肪分解酶PPARγ、LIPC的表达降低。而SelenoW敲除小鼠肝脏中HIF-1α、脂肪酸转运酶和合成酶的低于野生型,但脂肪分解酶高于野生型。在AML-12细胞模型中发现,过表达SelenoW显著增加了细胞中HIF-1α和脂质累积情况,而且脂肪酸转运酶和合成酶的活性上高,脂肪分解酶的表达降低。2DG能显著的缓解这些现象,SelenoW过表达细胞中加入BAY-87-2243能够抑制脂肪合成,并通过调控FABP4/PPARγ促进脂肪分解。结果表明,SelenoW敲除通过调节PKM2-HIF-1α改善高脂日粮诱导的小鼠肝脏中的脂肪代谢异常。综上所述,SelenoW敲除能够改善高脂日粮的诱导小鼠肝脏氧化应激,SelenoW靶向调控PKM2/HIF-1α的表达,降低小鼠肝脏中糖酵解代谢,缓解线粒体通路凋亡,抑制脂肪合成,促进脂肪分解。上述结果表明SelenoW靶向PKM2/HIF-1α信号调控了小鼠高脂日粮性脂肪肝形成。本研究结果阐明了SelenoW新的生物学功能,也为NAFLD的预防和治疗提供了新的靶点,为进一步探索SelenoW的功能提供参考。