【摘 要】
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烟粉虱(Bemisia tabaci)广泛分布于我国境内,是多种重要植物病毒的传播介体,对农业生产造成了严重损失。目前,我国境内对烟粉虱的防控主要依赖化学防治手段,综合防控措施的发展仍不够成熟。随着化学杀虫剂的大量使用,烟粉虱已对多种杀虫剂产生了抗性。蜘蛛等捕食者的毒液中,神经毒性多肽(神经毒肽)种类丰富且具有较强的杀虫活性。利用毒液中昆虫特异性的神经毒肽防控害虫,既可有效延缓抗性的产生,也能减少
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烟粉虱(Bemisia tabaci)广泛分布于我国境内,是多种重要植物病毒的传播介体,对农业生产造成了严重损失。目前,我国境内对烟粉虱的防控主要依赖化学防治手段,综合防控措施的发展仍不够成熟。随着化学杀虫剂的大量使用,烟粉虱已对多种杀虫剂产生了抗性。蜘蛛等捕食者的毒液中,神经毒性多肽(神经毒肽)种类丰富且具有较强的杀虫活性。利用毒液中昆虫特异性的神经毒肽防控害虫,既可有效延缓抗性的产生,也能减少常规化学杀虫剂对生态环境及食品安全的威胁。然而,开发利用蜘蛛毒液多肽防控烟粉虱的研究仍处于空白阶段。应用神经毒肽防控害虫的关键在于将其运输至昆虫血淋巴中的靶标位点。目前,利用昆虫病原真菌及纳米技术等手段可帮助神经毒肽穿越昆虫体表屏障进入血淋巴,但是该种方法的特异性较差。此外,利用虫传病毒的外壳蛋白(capsid protein,CP)作为运载蛋白可增强神经毒肽穿越昆虫肠道屏障进入血淋巴的能力,起到特异性的杀虫效果。为探索蜘蛛毒液中毒性多肽在烟粉虱防控中的应用前景,本研究首先筛选了部分神经毒肽并验证其对烟粉虱的血淋巴毒性。同时,我们尝试利用烟粉虱特异性传播的菜豆金黄花叶病毒属病毒的外壳蛋白帮助神经毒肽穿越烟粉虱中肠屏障进入血淋巴。主要结果如下:1)毒性多肽的筛选及其对烟粉虱血淋巴毒性的验证通过对已有报道的毒性多肽的筛选,我们得到了8个具有抗烟粉虱潜力的毒性多肽。随后,我们选取了其中5个神经毒肽并利用显微注射技术测定其对烟粉虱的血淋巴毒性。结果表明,ω-HXTX-Hv1a(Hv1a)、μ-AGTX-Aa1a(Aa1a)神经毒肽对烟粉虱存在一定的血淋巴毒性,显微注射GST-Hv1a、GST-Aa1a后,烟粉虱死亡率显著上升,产卵量显著降低。2)病毒外壳蛋白融合毒肽的经口毒性验证通过人工饲喂实验,我们对GST-Hv1a、GST-Aa1a的经口毒性进行了验证,结果表明其对烟粉虱的存活率没有显著影响。随后,通过对不同病毒CP可溶性的比较,我们选用了木尔坦棉花曲叶病毒(cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)的CP作为Hv1a的运载蛋白,进行融合表达后饲喂烟粉虱验证其经口毒性,结果表明其对烟粉虱的存活率同样没有显著影响。3)表达病毒外壳蛋白转基因植物的构建为进一步探索病毒CP在帮助神经毒肽进入烟粉虱血淋巴中的作用,我们首先在本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达CP并证实了烟粉虱可取食植物中表达的CP。随后,荧光共聚焦结果显示Hv1a-GFP可在本氏烟中正常发出荧光,CP-GFP与GFP-CP则无法正常发出荧光。同时,本研究构建了Hv1aGFP、CP-GFP转基因拟南芥,验证后获得了可正常表达Hv1a-GFP蛋白的拟南芥,但并未获得可正常表达CP-GFP的转基因拟南芥。后续的研究中,利用GFP荧光可观察烟粉虱取食后CP及Hv1a在烟粉虱体内的分布情况。综上所述,本研究筛选了具有抗烟粉虱潜力的神经毒肽并验证了Hv1a及Aa1a对烟粉虱的血淋巴毒性。随后,我们尝试利用病毒CP作为运载蛋白帮助毒性多肽穿越烟粉虱中肠屏障。我们通过瞬时表达技术验证了烟粉虱能够取食植物中表达的CP,并构建了Hv1a-GFP及CP-GFP转基因植物用于观察CP作为运载蛋白帮助神经毒肽进入血淋巴的潜力。本研究为筛选合适的蜘蛛毒肽开发针对烟粉虱或半翅目昆虫的生物杀虫剂提供了参考,同时也为后续抗烟粉虱转基因植物的开发起到了一定的借鉴意义。
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