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蛋白(多肽)药物是一类重要的生物大分子药物,有超过100种上市药物,全球年销售额约1000亿美元且迅速增长。然而,许多蛋白(多肽)药物的制备上存在严重的瓶颈,如大肠杆菌重组表达蛋白常遇到表达为无活性包涵体的问题,化学法在大于30个氨基酸的蛋白(多肽)合成上效率低、成本高的问题。本文基于实验室所创建的可切割自聚集标签(cleavable self-aggregating tag, cSAT)蛋白(多肽)表达与纯化技术,对一种蛋白药物人生长激素(hGH)和两种多肽药物胰岛素样生长因子1(IGF-1)、B型肭尿肽(BNP)的制备进行研究。
cSAT由自组装短肽和自切割内含肽组成。本文首先以hGH的高效制备为目标,对四种自组装短肽:类表面活性剂短肽L6KD、卷曲螺旋短肽α3-peptide和β折叠短肽EFK8、ELK16进行考察,优化cSAT法。这四种自组装短肽均能将hGH诱导形成活性聚集体,并通过体外切割获得活性hGH。通过对IPTG浓度和表达温度进行优化,L6KD、α3-peptide和EFK8融合hGH的最优条件为0.2mMIPTG于18℃表达18小时,ELK16融合hGH的最优条件为0.2mMIPTG于30℃表达6小时。hGH活性聚集体的表达量为44.9-158.3μg/mg细胞湿重,占hGH融合蛋白的29.5-86.7%。hGH活性聚集体在体外通过DTT诱导自切割后释放至上清中,获得2.8-21.4μg/mg细胞湿重,hGH总体的回收率为9.1-30.2%。其中,L6KD自组装短肽为最优,可获得21.4μg/mg细胞湿重即56.9mg/L发酵液的hGH,cSAT法一步纯化的纯度为88.2%。通过UPLC-TOF/MS的质谱检测发现所制备的hGH分子量为22678Da,与计算值相符。在刺激Nb2-11细胞系增殖活性上,所制备hGH的活性是商业hGH的80%。ELISA测定显示,在3.96ng/mL的最低浓度下,所制备hGH具有良好的敏感性。进一步,通过引入SpyTag/SpyCatcher,尝试对cSAT法优化,并采用hGH、IGF-1和BNP三种目标蛋白(多肽)进行测试,结果表明SpyTag/SpyCatcher体系与cSAT法可能不适用。
cSAT由自组装短肽和自切割内含肽组成。本文首先以hGH的高效制备为目标,对四种自组装短肽:类表面活性剂短肽L6KD、卷曲螺旋短肽α3-peptide和β折叠短肽EFK8、ELK16进行考察,优化cSAT法。这四种自组装短肽均能将hGH诱导形成活性聚集体,并通过体外切割获得活性hGH。通过对IPTG浓度和表达温度进行优化,L6KD、α3-peptide和EFK8融合hGH的最优条件为0.2mMIPTG于18℃表达18小时,ELK16融合hGH的最优条件为0.2mMIPTG于30℃表达6小时。hGH活性聚集体的表达量为44.9-158.3μg/mg细胞湿重,占hGH融合蛋白的29.5-86.7%。hGH活性聚集体在体外通过DTT诱导自切割后释放至上清中,获得2.8-21.4μg/mg细胞湿重,hGH总体的回收率为9.1-30.2%。其中,L6KD自组装短肽为最优,可获得21.4μg/mg细胞湿重即56.9mg/L发酵液的hGH,cSAT法一步纯化的纯度为88.2%。通过UPLC-TOF/MS的质谱检测发现所制备的hGH分子量为22678Da,与计算值相符。在刺激Nb2-11细胞系增殖活性上,所制备hGH的活性是商业hGH的80%。ELISA测定显示,在3.96ng/mL的最低浓度下,所制备hGH具有良好的敏感性。进一步,通过引入SpyTag/SpyCatcher,尝试对cSAT法优化,并采用hGH、IGF-1和BNP三种目标蛋白(多肽)进行测试,结果表明SpyTag/SpyCatcher体系与cSAT法可能不适用。