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椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)性疾病在临床上发病率高,是导致成人劳动力受限的主要原因,给社会造成巨大的经济负担。糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者与非DM患者相比IVDD患病率显著升高,椎间盘内的高糖环境通过氧化应激(oxidative stress,OS)损伤引起髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)数目减少、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成降解代谢紊乱是引起IVDD的因素之一。近年研究发现雌激素不但可以刺激胰岛素分泌改善胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)而且部分抑制NPCs凋亡,但是迄今尚未见关于17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)与高糖诱导NPCs凋亡相关方面的报道,因此,本实验首先通过胰酶联合Ⅱ型胶原酶体外分离培养并鉴定大鼠原代NPCs;再者探讨17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs凋亡及ECM合成代谢的影响并揭示其可能的机制,另外明确雌激素受体β(estrogen receptor β,ERβ)在其中的介导作用。第一部分 原代大鼠髓核细胞的体外分离培养及鉴定目的:原代大鼠NPCs体外分离培养及鉴定。方法:通过胰酶联合Ⅱ型胶原酶体外分离大鼠原代NPCs并传代;通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增产物电泳检测NPCs标志物基因碳酸酐酶12(carbonic anhydrase 12,CA12)、叉头框F1(forkhead box F1,FOXF1)、多效生长因子(pleiotrophin,PTN),免疫细胞化学染色聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGG)和Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ,Col Ⅱ)及性别决定区Y高迁移率族蛋白盒9(Sry-type HMG box 9,SOX9)来鉴定大鼠原代NPCs。结果:成功分离培养、鉴定原代大鼠NPCs并传代。结论:通过细胞形态学、新型标志物基因、胞外基质标志蛋白及SOX9成功鉴定了NPCs。第二部分17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞凋亡及胞外基质合成的影响目的:离体试验中探讨17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs凋亡及ECM合成代谢的影响,并探讨ERβ在其中的介导作用。方法:原代NPCs传代,取第2代NPCs随机分为四组:高糖组(HG组,培养基中含有0.2 M葡萄糖)、高糖+17E2组(HG+17E2组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2)、高糖+17E2+ERB041 组(HG+17E2+ERB041 组,培养基中含有0.2 M 葡萄糖+10-7M 17β-E2+10 的 ERB041)、高糖+17E2+PHTPP 组(HG+17E2+PHTPP组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2+1μM的PHTPP);干预72小时后,采用1)Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;2)实时荧光定量PCR(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、Caspase-3)的基因表达;3)Western blot 检测凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-3、Cleaved PARP)细胞中的表达;4)RT-PCR检测ECM Col Ⅱ和AGG基因表达;5)免疫细胞化学染色检测ECM Col Ⅱ及AGG的蛋白表达。结果:高糖状态下大鼠NPCs凋亡率增加,ECM Col Ⅱ及AGG合成代谢减少;17β-E2干预后可以减少高糖状态下的大鼠NPCs的凋亡率,下调促凋亡因子(Bax、Caspase-3)基因表达,上调抗凋亡因子(Bcl-2)基因表达,降低凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-3、Cleaved PARP)在细胞中的表达;增加ECM Col Ⅱ及AGG基因表达及蛋白表达;联合使用ER β受体激动剂ERB041及17β-E2较单用17β-E2进一步减少了高糖状态下NPCs凋亡率,下调促凋亡因子(Bax、Caspase-3)基因表达,上调抗凋亡因子(Bcl-2)基因表达,降低凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-3、Cleaved PARP)在细胞中的表达;进一步增加了 ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢,联合使用ERβ受体抑制剂PHTPP及17β-E2较单用17β-E2增加了高糖状态下NPCs凋亡率,上调了促凋亡因子(Bax、Caspase-3)基因表达,下调了抗凋亡因子(Bcl-2)基因表达,增加了凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-3、Cleaved PARP)在细胞中的表达;减弱了 ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢。结论:高糖状态下大鼠NPCs凋亡增加,ECM Col Ⅱ及AGG合成代谢减弱;17β-E2可通过ER β介导降低高糖状态下的大鼠NPCs的凋亡率,增加ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢。第三部分17β-雌二醇通过雌激素受体β介导抑制高糖状态下大鼠髓核细胞内氧化应激损伤目的:观察17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影响,并明确其与ER β的相关性。方法:取第2代NPCs随机分为四组:高糖组(HG组,培养基中含有0.2 M葡萄糖)、高糖+17E2组(HG+17E2组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2)、高糖+17E2+ERB041组(HG+17E2+ERB041组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7 M 17β-E2+10 μM 的 ERB041)、高糖+17E2+PHTPP 组(HG+17E2+PHTPP 组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2+1 μM的PHTPP);干预72小时后,采用DCFH-DA法检测各组细胞内ROS水平。结果:各组细胞内ROS检测结果提示:HG+17E2组细胞内ROS水平低于HG组(P<0.05),HG+17E2+ERB041 组细胞内 ROS 水平低于 HG+17E2 组(P<0.05),HG+17E2+PHTPP 组细胞内 ROS 水平高于 HG+17E2组(P<0.05)。结论:17β-E2可降低高糖状态下大鼠NPCs内ROS水平,ER β介导这一过程发生。