马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)保幼激素降解酶基因的分子克隆及功能分析

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保幼激素(Juvenile hormone,JH)调控昆虫生长、发育、变态和生殖。血淋巴中保幼激素的滴度是由保幼激素的合成和代谢共同维持和平衡。JH的降解主要通过三个酶完成:保幼激素酯酶、保幼激素环氧化水解酶和保幼激素二醇激酶。本文采用生物信息学和分子生物学技术,获得了保幼激素环氧化水解酶和保幼激素二醇激酶的全长cDNA序列,并通过RNA干扰技术验证了二者的功能。同时,我们也克隆了 一个可能的保幼激素酯酶基因。结果如下。1、马铃薯甲虫保幼激素环氧化水解酶基因的分子克隆及其功能分析克隆了马铃薯甲虫保幼激素环氧化水解酶的两条cDNA序列,并将其分别命名为LdJHEH1和LdJHEH2。在马铃薯甲虫3日龄四龄幼虫体内,LdJHEH1和LdJHEH2在胸肌、脑-心侧体-咽侧体复合体、前肠、中肠、后肠、腹神经节、马氏管、脂肪体、表皮、血细胞、雌成虫的卵巢以及雄性生殖腺中均表达。LdJHEH1和LdJHEH2在马铃薯甲虫的不同发育阶段也持续表达,且在末龄幼虫蜕皮后32小时表达量最高。取食dsLdJHEH1、dsLdJHEH2或其混合物均成功敲低了目标基因,显著影响了保幼激素的降解,增加了LdKr-h1表达量,略微降低幼虫体重,延缓幼虫的生长发育,显著影响成虫的羽化率。综上所述,LdJHEH1 和LdJHEH2在保幼激素的降解过程中发挥重要作用。2、马铃薯甲虫保幼激素二醉激酶基因的分子克隆及其功能分析马铃薯甲虫保幼激素二醇激酶cDNA(LdJHDK)的开放阅读框编码蛋白的长度为184个氨基酸残基。LdJHDK在嘌呤核苷酸结合位点有三段保守的序列,以及三个EF-hand基序,且与钙结合蛋白相似性较高。LdJHDK在后肠和马氏管中表达量较高。LdJHDK在整个生长发育阶段均表达。在马铃薯甲虫一、二和三龄幼虫中,LdJHDK的表达量在幼虫蜕皮前后出现高峰,而在龄期中期表达量相对较低。在四龄幼虫中,LdJHDK的表达高峰在四龄幼虫蜕皮后的56小时左右。取食dsLdJHDK有效敲低了靶标基因,影响JH的降解,增加LdKr-h1的表达水平。此外,敲低LdJHDK略微影响幼虫的体重,延缓幼虫的生长发育,并显著影响成虫的羽化。因此,LdJHDK参与保幼激素的代谢过程。3、马铃薯甲虫羧酸酯酶基因的分子克隆以及对保幼激素酯酶的筛选基于马铃薯甲虫转录组数据库以及NCBI GenBank相关序列,鉴定了 70个新的羧酸酯酶和2个乙酰胆碱酯酶,它们都属于多功能羧酸酯酶/胆碱酯酶超家族。分为三个大类:解毒代谢类、激素/信息素加工类以及神经发育类,马铃薯甲虫酯酶在以上三大类中的数量分别为52、12和8。应用RT-PCR和RACE技术获得了马铃薯甲虫保幼激素酯酶疑似基因KM220550的全长cDNA序列,序列分析和时空表达谱的结果均显示其具有保幼激素酯酶的基本特征。此外,在新克隆的70个新的羧酸酯酶基因中,KM220566、KM220530、KM220576、KM220527 和 KM220541 5 个酯酶被氟虫腈诱导,而 KM220578、KM220566、KM220542、KM220564、KM220561、KM220554、KM220527、KM220538和KM220541 9个酯酶被三氟氯氰菊酯诱导。我们认为以上14个酯酶在马铃薯甲虫中可能参与杀虫剂的解毒代谢。
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