CRISPR (clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)序列源于原核生物的一种获得性免疫系统,基于RNA介导的CRISPR-Cas系统可定点修饰(删除、添加、激活、抑制)靶细胞中特定的基因序列。自2013年以来,CRISPR-Cas9系统已成功应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇、线虫、拟南芥、水稻等物种中。大麦是世界上重要的粮食作物之一,其富含维生素E,尤其含有人体易于吸收且生物活性高的α-生育酚。维生素E的合成途径复杂,有八种类型的产物(δ、γ、β、α-生育酚,δ、γ、β、α-生育三烯酚)。HGGT基因(homogentisate geranylgeranyl transferase gene)和HPT基因(homogentisate phytyltransferase gene)分别是生育酚和生育三烯酚合成的两个关键调控基因。目前,CRISPR-Cas9系统作为新型的基因组编辑技术在大麦中的应用尚未见报道。在本研究中,我们主要开展了CRISPR-Cas9系统在大麦原生质体水平上的研究,通过对HGGT基因编辑系统的建立以期达到调控维生素E合成的目的。本研究比较了不同CRISPR-Cas9系统载体Cas9蛋白在大麦中的表达水平,针对靶基因HGGT设计特定靶位点并进行了基因突变实验,采用RE-qPCR (Restriction enzyme-quantitative PCR)方法计算基因突变率。此外我们还比较了两种突变检测万法(RE-PCR和PCR-RE)。获得主要结果如下1. Cas9蛋白在大麦原生质体中的表达水平以pRGE载体为基本骨架,构建了适用于植物的CRISPR-Cas9系统载体。Western Blot结果显示,细菌来源的Cas9蛋白在大麦中的表达量较低,经过密码子优化和选用UBI10启动子可以大幅度提高Cas9蛋白在大麦中的表达水平。2.靶位点的设计以及表达载体的构建选择大麦维生素E合成途径中的HGGT基因作为靶基因,以pRGE32载体为基本骨架,针对HGGT基因的三个位点,构建了三个突变单一靶位点的sgRNA(single gRNA)体系载体pRGE32-HGGT-1、pRGE32-//GGT-2 pRGE32-HGGT-3和一个同时突变两个靶位点的PTG(Polycistronic-tRNA-gRNA)体系载体pRGE32-HGGT-PTG1。3.突变检测方法的比较传统的T7E1酶检测突变体的方法稳定性较差,本实验选取了带有常见限制性内切酶酶切位点的序列作为靶位点,便可根据该位点是否能被原有的限制性内切酶切开来筛选突变DNA序列,采用RE-PCR法(先酶切再PCR)和PCR-RE法(先PCR再酶切)均成功检测到靶位点发生了突变。结果显示,PCR-RE法更加简便快捷,反应条件稳定,限制性因素少,还有利于后续突变片段的回收。4.突变率、突变类型的统计与计算回收的突变片段连接pGEM-T载体后,随机挑取单克隆测序,可以直接统计突变类型并计算突变率。本实验中采取了简单有效、成本低的RE-qPCR方法来间接计算突变率。针对单一靶位点编辑,RE-qPCR实验结果显示HGGT-1位点突变率为4.56%,HGGT-2位点为0.35%,HGGT-3位点为1.51%。测序结果显示,CRISPR-Cas技术在大麦原生质体水平进行HGGT基因编辑,主要导致点突变(T-C置换、A-G置换)和片段缺失(20 bp靶位点不同长度的缺失),分别占总突变的89.47%和10.53%,其中HGGT-1位点突变率为35%,HGGT-3位点为15%, HGGT-PTG1位点为35%。RE-qPCR和测序结果均表明HGGT基因的三个不同位点突变率相差很多,HGGT-1位点最高,HGGT-3位点其次,HGGT-2位点没有检测到突变。该实验说明不同靶位点的突变效率差异很大,因此进行高效编辑靶位点的筛选显得十分重要。综上所述,我们的实验结果证实了CRISPR-Cas技术作为基因组编辑工具能够在大麦细胞体系中有效应用。在原生质体水平进行高效编辑靶位点的筛选,为今后稳定转化大麦提供可靠的实验依据。