目的：鸟分枝杆菌是细胞内寄生菌,在艾滋病晚期常可发生鸟分枝杆菌的扩散性感染。巨噬细胞作为分枝杆菌的宿主细胞,其内微环境包含有多种杀(抑)菌机制,比如酸、活性氧(ROS,如02、H2O2)和活性氮(RNS,如NO、NO2)、多种溶菌酶、抗菌肽等。这些机制的存在,理论上可以有效的抑制进入巨噬细胞的病原细菌。但是,某些病原细菌在感染早期显然能够耐受这些杀(抑)菌机制,在巨噬细胞内大量繁殖,为后续全身性的胞外感染奠定基础。本文通过构建鸟分枝杆菌基因组文库,筛选耐受活性氮和活性氧相关基因,以探讨鸟分枝杆菌适应巨噬细胞的杀(抑)菌机制,为深入研究鸟分枝杆菌的致病机理给出新的线索,进而为新药物的开发提供可能的靶点。方法： (1)利用CTAB法提取鸟分枝杆菌基因组DNA,用Sau3A Ⅰ部分酶切后与用BamH Ⅰ酶切并经磷酸化处理的pUC19质粒连接,转化大肠杆菌JM109,构建鸟分枝杆菌基因组文库；(2)利用生物活性水平筛选方法,通过含有NaNO2的培养液,从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选耐受活性氮的克隆子；(3)对所得的克隆子进行测序以获取插入片段的序列,通过生物信息学分析获取插入序列的信息和目的基因；(4)根据目的基因的开放阅读框架设计引物,利用PCR扩增目的基因,与相应的表达载体连接后构建重组表达质粒；(5)重组表达质粒在大肠杆菌诱导表达及表达产物的SDS-PAGE检测；(6)分别以NaNO2、GSNO、H2O2、SDS作为胁迫,通过计算平板菌落数(CFU)或测定吸光度值,分析重组目的基因的耐受性。(7)利用生物信息学对目的基因编码蛋白的理化性质、空间结构和功能位点进行预测分析。结果：构建的鸟分枝杆菌基因组文库滴度为8×103cfu/ml,随机挑选10个克隆进行BamH I酶切分析,可见插入片段大小约在100-750bp之间,基本达到文库建立的要求。通过含有NaNO2的培养液,从构建的鸟分枝杆菌基因组文库中筛选到一个耐受活性氮的克隆子,测序结果分析表明,该克隆子的插入序列有两个读码框,一个编码目的基因(取名为noA),另一个编码P49蛋白基因,分别处在插入序列的两条链上。构建noA重组表达质粒做NaNO2、GSNO、H2O2、SDS胁迫试验,结果显示noA耐受NaNO2、 GSNO2、H2O2的能力明显高于对照,而其耐受SDS的能力与对照没有显著性差异。结论：从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选到一个能抵抗NaNO2、 H2O2胁迫的基因-noA,这是一个新型的耐受活性氧和活性氮基因。从预测的理化性质、功能位点及结构特点推断,noA蛋白有可能成为诊断、治疗或者预防鸟分枝杆菌病的有价值的靶分子。