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目的探讨Rab5a与肝细胞癌发生发展之间的联系,揭示Rab5a促进肝癌细胞迁移和侵袭的新机制,为临床治疗肝细胞癌提供依据。方法1.用免疫组化方法和q RT-PCR检测人肝癌组织及癌旁组织中Rab5a的表达水平。2.用q RT-PCR和Western blotting方法检测肝癌细胞系中Rab5a的表达量。3.构建Rab5a表达质粒(p CMV-Sport6-Rab5a),合成干扰片段(si-Rab5a)。在SK-Hep1和SMMC7721细胞系中用qRT-PCR和Western blot方法检测过表达和siRNA效率。4.transwell实验和伤口划痕实验,在HepG2和SK-Hep1细胞中分别转染pCMV-Sport6-Rab5a(pCMV-Sport6作为对照)和siRab5a(Si-NC作为对照),检测细胞的转移能力。5.在SK-Hep1细胞中转染p CMV-Sport6-Rab5a和si-Rab5a,用q RT-PCR和Western blotting方法检测与转移相关的基因,如:FOXC2,TP53,VEGF,MMp2,Cdc42等的表达情况。6.构建含有Cdc42基因启动子(-1002bp~+20bp)的pGL3-Basic-Cdc42载体,进行荧光素酶报告基因分析,检测Cdc42启动子活性。7.在裸鼠肝脏内注射稳定表达Rab5a的SK-Hep1细胞(慢病毒载体p CDH-CMV-cop GFP-Rab5a),用免疫组化方法分析肝脏和肺部里肿瘤细胞的迁移情况。结果1.免疫组化和q RT-PCR检测显示,与癌旁组织相比,在肝癌组织中,Rab5a的表达显著增高。2.q RT-PCR和western blotting结果显示,与肝正常细胞系(L02)相比,在3种肝癌细胞系(SMMC7721,SK-Hep1和HepG2)中,Rab5a基因的m RNA和蛋白水平显著上调。3.在SK-Hep1细胞系中,p CMV-Sport6-Rab5a表达显著增高15倍,在SMMC7721细胞系中增高20倍。相反的,si-Rab5a后尤其是si-Rab5a(661),在SK-Hep1细胞系和SMMC7721细胞系中能显著抑制Rab5a的表达。4.在Hep G2和SK-Hep1细胞中,Rab5a过表达促进侵袭活性,而Rab5a沉默抑制侵袭。伤口划痕实验显示,在SK-Hep1细胞中p CMV-Sport6-Rab5a促进迁移,而Rab5a沉默抑制迁移。5.在p CMV-Sport6-Rab5a组中,TP53,Cdc42,Rho A,Twist1和KLF4的表达增高,在si-Rab5a组中降低。其中TP53,Cdc42和Rho A蛋白水平与Rab5a的表达存在相关性。6.在pc DNA3.1-Rab5a和p GL3-Basic-Cdc42共转染组,Cdc42启动子活性较pc DNA3.1和p GL3-Basic-Cdc42共转染组更高。7.在p CDH-CMV-cop GFP-Rab5a组,Cdc42染色较对照组增强,因此,提示在体内Rab5a通过调节Cdc42表达促进肝癌细胞发展。结论在肝细胞癌组织和3种肝癌细胞系中Rab5a的表达较正常肝组织和肝细胞增高。无论在体内或体外,过表达Rab5a能促进细胞侵袭和迁移。机理研究发现,Rab5a能通过增强Cdc42基因的启动子活性,调控Cdc42的表达。这些结果提示Rab5a通过调节Cdc42的表达促进细胞的迁移和侵袭。