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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,为单股正链RNA病毒,基因组全长约15kb,含有9个开放性阅读框。开放性阅读框1a(ORF1a)和开放性阅读框1b(ORF1b)占整个基因组的80%。ORF1a上游编码一个单个的聚合蛋白1a(pp1a),该聚合蛋白被预测可被切割成8个非结构蛋白,即NSP1-8。ORF1b下游编码一个聚合蛋白,其与pp1a共同参与核糖体移码的机制。ORF1ab的基因产物与聚合蛋白1ab(pp1ab)有关。ORF1b编码的聚合蛋白可被水解蛋白酶裂解,形成NSP9-12的多肽。剩余的开放性阅读框(2a,2b和3-7)编码病毒的结构性糖蛋白2a、3、4、5(GP2a,GP3,GP4,GP5),非糖基化的2b/E,膜蛋白和核蛋白。
RNA干扰(RNAi)是小干扰RNA分子引起的自然发生的基因抑制的细胞机制,其中这些siRNA与靶基因的某些区域具有同源性。RNAi的应用可通过两种类型的分子调节:一种是化学合成的双链小干扰RNA(siRNA),另外一种是连接载体的小发夹RNA(shRNA)。为了达到shRNA有效构建的高效能和可持续的效应,通常利用低拷贝数的shRNA,减少脱靶效应,并且其可诱导哺乳动物细胞产生长效性的RNA沉默,而小干扰RNA在转染的动物细胞中的效应相比较而言,比较短暂。最近几年,RNA干扰作为一种实验室工具从而被广泛应用,主要用于病毒和细胞基因功能的研究,从而达到识别基因调节病毒感染和复制的目的,并且可作为一种新的治疗病毒感染的可行性的方法。
在本研究中,我们分别设计了两条靶向PRRSV NSP12基因的shRNA,以期通过RNA干扰来研究NSP12基因的功能。实验结果显示,两条shRNA均可有效地抑制PRRSV在Marc-145细胞中的复制。另外,我们证明靶向NSP12的shRNA可抑制PRRSV亚基因组的复制与翻译。