研究背景和目的在全球范围内,膀胱癌是人类的常见恶性肿瘤之一。其发病率居恶性肿瘤的第十一位,在男性患者中排在第七位,女性发病率稍低,排在第十位之后。同样,在我国,男性膀胱癌的发病率较高,排在第七位,女性则排在第十位以后。膀胱癌有多种病理类型,其中以移行上皮细胞癌较多见,约占90%。全程无痛性血尿是膀胱癌的常见症状。随着诊断技术的进步,临床上早期膀胱癌越来越多见。相应的传统治疗方式多为手术治疗,辅以化疗、放疗及免疫治疗,治疗效果良好。但是,这些治疗方法多为有创和侵入性的。尽管卡介苗免疫治疗具有无创、疗效明显的优点,但对低危膀胱癌无明显疗效。为此我们需要寻找一种可以无创、广适应的药物治疗相应的患者。1922年,McCollum证实鱼肝油中含有一种维生素可以使骨矿化,对佝偻病治疗有效,并将其命名为“维生素D”。维生素D3(C27H44O)是体内维生素D的主要成分,是一种脂溶性维生素。经肝脏、肾脏代谢后依次转化为25-(OH)D3和1,25-(OH)2D3。2015年,循证医学证据表明,25-(OH)D3能降低膀胱癌的发病风险(Liao Y et al,Tumour Biol)。骨化三醇,即1,25-(OH)2D3,作为维生素D3的主要活性形式存在于机体内发挥着调节体内钙磷代谢并维持其平衡的生理作用。同时,近年来随着研究的深入骨化三醇还有调节细胞增殖、分化及凋亡等抑制肿瘤的生物功能。另外,已有文献报道骨化三醇亦有抑制膀胱癌细胞的增殖能力及促进其凋亡的作用(Konety BR et al,J Urol)。那么作为25-(OH)D3、1,25-(OH)2D3的前体,维生素D3(C27H44O)是否对于膀胱癌细胞也有类似的生物功能?维生素D3是通过何种生物途径发挥着这些生物功能?自噬是指真核细胞中双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体,并与内含体融合形成自噬内含体,最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以维持细胞的内稳态和实现细胞器的更新。自噬在进化上高度保守,广泛发生于真核细胞的病理与生理过程中,是细胞程序性死亡的方式之一,同时也是细胞的自我保护机制。多年的研究表明,自噬在神经系统疾病、免疫、肿瘤的发生及凋亡等方面发挥着重要作用。自噬的研究方法有很多种,证明自噬的方法也有很多种。其中以电子显微镜直接观察自噬体结构为金标准,以检测自噬标记蛋白LC3Ⅱ型蛋白较为简便。综上,本文即着手研究维生素D3(C27H44O)对膀胱癌细胞的影响及其与自噬的关系。研究方法1、维生素D3实验浓度(IC50)的测定EJ细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中,5%CO2、37℃恒温孵箱培养。至对数生长期,调整长势良好的EJ细胞浓度为4×104个/孔接种于96孔培养板。分别于以DMSO为溶媒介质溶解稀释后浓度为1、1.5、2、2.5、3微摩尔/毫升维生素D3的完全培养基中孵育24小时和48小时,并设置对照组。以不含血清的RPMI 1640培养基稀释的体积分数为10%的CCK-8工作液孵育2小时,后经450纳米波长的酶标仪测定各孔的吸光值。下列公式计算细胞抑制率:抑制率/%=(A 对照组值-A实验组值)/(A对照组值)×100%。经计算(SPSS 20.0)得出EJ细胞的IC50,并以此IC50的估计值为终浓度进行以下实验,对照组加入等体积的DMSO(Dimethyl sulfoxide)。2、细胞迁移能力检测将在终浓度为1.226微摩尔/毫升维生素D3的含10%FBS的RPMI 1640完全培养基中培养24小时后处于对数生长期长势良好的EJ、UMUC-3细胞消化、离心后计数。稀释并调整至适宜浓度,取5×104个细胞加入8微米孔径的聚碳酸酯微孔膜Transwell小室中,在10%FBS浓度差异的诱导下分别培养12小时(EJ)和16小时(UMUC-3)。后经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、固定、染色、拍照、计数和统计分析后得出实验结果并记录。3、FCM检测细胞周期取对数生长期长势良好的EJ、UMUC-3细胞于维生素D3的终浓度为1.226微摩尔/毫升的含10%FBS的RPMI 1640完全培养基中培养24小时。收集细胞约为1×106个,经4℃预冷的PBS充分洗涤后加入体积分数为70%的乙醇(PBS稀释)于4℃固定过夜;20毫克/升的核糖核苷酸酶(RNase,KeyGEN)孵育30分钟(37℃);碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染液(终浓度100毫克/升)染色30分钟;流式细胞仪上机检测各细胞488纳米处的荧光强度并记录。4、细胞增殖活性检测取同等数量对数生长期长势良好的膀胱癌细胞(EJ、UMUC-3)分别均匀接种于6孔培养板上,于含终浓度为1.226微摩尔/毫升的维生素D3的完全培养基中连续培养72小时。在培养过程中0小时、24小时、48小时、72小时时于倒置显微镜下观察细胞生长情况并在固定视野拍照记录细胞生长情况;取对数生长期长势良好的膀胱癌细胞(EJ、UMUC-3)1×103个/孔接种于96孔培养板,在含终浓度为1.226微摩尔/毫升的维生素D3的完全培养基中培养0小时、24小时、48小时、72小时、96小时,加入10%不含胎牛血清的RPMI 1640稀释的CCK-8工作液孵育2小时后于450 nm波长的酶标仪测定各孔的吸光值,统计并分析;取对数生长期长势良好的细胞(EJ、UMUC-3)500个/孔接种于6孔培养板中,在含终浓度为1.226微摩尔/毫升维生素D3的完全培养基中连续培养12天后去除培养基,洗涤后4%多聚甲醛室温固定30分钟,苏木素60℃染色30分钟,清水洗涤后拍照,计数、统计并记录实验结果。5、Western Blot检测自噬标记蛋白LC3Ⅱ型蛋白的表达取对数生长期细胞接种于6孔培养板,加入含终浓度为1.226微摩尔/毫升维生素D3的完全培养基,并设置对照组。分别培养3小时、6小时、12小时、24小时后收集细胞。RIPA裂解液+1%PMSF超声辅助充分裂解细胞,12000转每分钟4℃离心30分钟。取上清液,BCA测定蛋白浓度,5×loading buffer 100摄氏度水浴5分钟变性。取总蛋白量为30微克的样品,10%SDS-PAGE凝胶80V 30分钟和100V 100分钟电泳。0.22微米孔径的PVDF膜,150mA转膜45分钟。5%脱脂奶粉封闭1小时,1:1000Anti-LC3 4℃孵育过夜。0.1%PBST摇洗4次,1:5000山羊抗鼠二抗室温孵育1小时,0.1%PBST摇洗4次,ECL化学发光仪(TANON)曝光,Image J灰度分析软件测量后记录。6、共聚焦荧光显微镜免疫荧光法观察LC3Ⅱ型蛋白的表达取对数生长期细胞2×103个接种于10毫米共聚焦小皿,加入含终浓度为1.226微摩尔/毫升维生素D3的完全培养基。分别培养6小时(UMUC-3)和12小时(EJ);PBS洗涤后4%多聚甲醛室温固定30分钟,PBS摇洗3分钟×4;滴加正常山羊血清室温封闭1小时;滴加足量1:150Anti-LC3一抗、4℃孵育过夜;于暗室滴加足量1:200 FITC标记的山羊抗鼠荧光二抗、室温孵育1小时;0.1%PBST摇洗3分钟×5次,滴加100纳克/毫升的DAPI染液避光孵育10分钟以复染核,0.1%PBST洗涤3分钟×6;共聚焦荧光显微镜下避光环境中观察并采集图像。7、统计学分析所有数据均采用SPSS20.0统计软件进行数据分析处理。定量资料采用均数±标准差(x±SD)表示。细胞迁移实验、细胞周期检测、平板克隆实验结果采用两独立样本t检验,方差不齐时采用近似t检验;CCK-8体外增殖实验采用析因设计的方差分析,经Levene方差齐性检验,方差齐时采用LSD法比较,方差不齐时采用Dunnet’s T3法比较。按P<0.05为标准,差异具有统计学意义。研究结果1、维生素D3实验浓度(IC50)的测定本实验中1-3微摩尔/毫升浓度的维生素D3作用于EJ细胞后,细胞的增殖抑制率随药物浓度的增加而增大。根据相应抑制率拟合得出回归曲线y=0.7012x-0.8686,决定系数R2=0.9515。经计算测得维生素D3的IC50为0.919-1.436微摩尔/毫升、估计值为1.226微摩尔/毫升。2、维生素D3对于膀胱癌细胞迁移能力的影响维生素D3作用于膀胱癌细胞EJ 12H后,实验组(58.8±27.67)与对照组(83±21.30)穿过聚碳酸酯微孔膜的细胞数无明显差异,P>0.05;维生素D3作用于膀胱癌细胞UMUC-3 16H后,实验组(1 04.2±9.20)与对照组(109.6±1 1.59)穿过聚碳酸酯微孔膜的细胞数无明显差异,P>0.05。3、维生素D3对于膀胱癌细胞周期的影响维生素D3作用于膀胱癌细胞EJ、UMUC-3后,实验组处于S期和G2/M期的细胞均多于对照组,实验组处于G1期的细胞均较对照组减少。EJ实验组:G1 期 69.89±0.54%、S 期 25.99±0.26%、G2/M 期 4.12±0.28%,EJ 对照组:G1期 77.54±0.54%、S 期 20.11±0.40%、G2/M 期 2.35±0.23%;UMUC-3 实验组:G1 期 41.99±0.94%、S 期 35.16±0.76%、G2/M 期 22.86±0.32%,UMUC-3 对照组:G1 期 49.94±2.23%、S 期 31.45±2.28%、G2/M 期 18.61±0.97%。实验组与对照组各期之间均有统计学意义,P<0.05。4、维生素D3对于膀胱癌细胞增殖能力的影响维生素D3作用于EJ、UMUC-3细胞后,直接观察法可见到0小时实验组细胞数≥对照组、24小时实验组细胞数开始少于对照组、48小时及72小时实验组细胞数明显少于对照组;CCK-8法实验结果提示维生素D3能显著抑制膀胱癌细胞的增殖能力,细胞水平与时间水平之间存在交互效应,各组各检测时间点具有显著性差异,P<0.05;平板克隆法可见实验组细胞克隆团数(EJ:28±4、UMUC-3:25.67±4.51)明显少于对照组(EJ:52±7.55、UMUC-3:70.67± 18.04),实验组与对照组有显著性差异,P<0.05。5、维生素D3与LC3的关系维生素D3作用于膀胱癌细胞(EJ、UMUC-3)后,蛋白免疫印记实验显示加入维生素D3 12H(EJ)、6H(UMUC-3)时实验组LC3 Ⅱ/Ⅰ 比值较对照组增高,自噬标记蛋白LC3Ⅱ型蛋白表达增多;共聚焦荧光显微镜免疫荧光实验也在实验组检测到明显的LC3绿色荧光点状聚集物,而对照组却未检测到。结论:1、维生素D3作用于膀胱癌EJ细胞的的实验浓度(IC50)为0.919-1.436微摩尔/毫升、估计值为1.226微摩尔/毫升;2、维生素D3对于膀胱癌细胞(EJ、UMUC-3)的迁移能力无明显影响;3、维生素D3能阻滞膀胱癌细胞周期于S期和G2/M期,并能明显抑制膀胱癌细胞的增殖能力;4、维生素D3可以通过诱导自噬抑制膀胱癌细胞的增殖能力。