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滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是感染鸡和火鸡的重要病原体之一,可引起急性或慢性传染性滑膜炎或气囊炎。当它与大肠杆菌、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等混合感染时,可导致更严重的疾病。除此之外,MS还可引起产蛋率下降和蛋壳顶端异常。近年来,MS感染在我国鸡群中广泛流行,对我国的养鸡业造成了严重的经济损失。因此,加强流行病学监测,阐明MS在我国鸡群中的传播和流行规律,对于MS感染的防控具有重要意义。本研究的主要目的是:(1)应用可变脂蛋白血凝素A基因(vlhA)序列分析与多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)对MS分离株进行基因分型,以期探明国内流行的优势基因型,揭示不同基因型MS菌株间的遗传进化关系;并通过溯源分析,阐明MS在我国的传播和流行状况,为有效防控MS感染提供数据支撑。(2)通过体外药敏试验来进行MS分离株耐药表型鉴定,随后根据耐药表型鉴定结果,挑选耐药菌株进行基因层面的耐药性研究,为临床用药提供依据。1.2016～2019年我国部分地区鸡滑液囊支原体流行病学调查与基因分型为了解我国MS感染的最新流行情况,本研究于2016年～2019年从江苏、安徽、山东、河南、河北、宁夏、黑龙江、湖北等8个省份疑似发生MS感染的鸡场采集样品,进行MS菌株的分离鉴定,共获得47个MS分离株。对这些分离株的vlhA基因片段测序和分析显示,其中46株均属于K基因型,剩下1株属于E基因型。研究结果表明,当前国内流行的MS优势基因型是K基因型,与其他国家和地区流行的基因型存在显著差异。vlhA分型具有简便、快速的优点,但区分度略显不足。而MLST分型基于Adk、atpG、Efp、Gmk、nagC、Ppa和recA等7对管家基因等位多态性对MS菌株进行分型,可以区分更多的亚群,更有利于研究病原的溯源和传播规律,因此同时又采用MLST的分型方法对47株MS分离株进行多位点序列分型研究。结果表明,47个分离株共被分成15种不同的新序列型,均属于同一个克隆组群。所有47株分离株均存在新等位基因序列,新等位基因序列的数量分别为:Adk(n=2)、atpG(n=2)、nagC(n=10)、recA(n=3),Efp、Gmk和Ppa没有发现新的等位基因序列。等位基因数量最多的是nagC(n=11),最少的是Gmk(n=1)和Ppa(n=1)。15种新序列型中,ST34序列型有 25 株,占分离株总数的 53.19%(25/47);ST93 有 8 株,占 17.02%(8/47);ST90有2株,占4.26%(2/47);其余12种序列型均只包含1株分离株,分别占分离株总数的2.13%(1/47)。MLST分型结果表明ST34为我国流行的优势序列型。通过BURST进行遗传聚类分析,将47个国内分离株和185个国外参考株共117种序列型分为15个克隆组群和一个单独型组群。本研究中分属于15个序列型的47个MS分离株均属于组群11,独立于其他14个克隆组群和单独型组群。表明我国流行的克隆组群为组群11,且与国外其余的克隆组群没有较大的联系,即具有很强的地域性。在185株MS国外菌株中,优势组群为组群12(22.16%)、组群9(13.51%)和组群6(9.19%),属于这三个组群的菌株占总MS参考株数的44.86%(83/185)。结合单参考株的国家分布,组群12和组群9可能为欧洲的优势克隆群组,也具有明显的地域性。综上所述,vlhA分型中的46株K基因型和1株E基因型MS均分属于MLST分型中的组群11中的15个序列型,两种分型方法的结果均表明当前我国流行的MS优势基因型表现出地方流行性的特点,与国外菌株相比具有独立的遗传起源。2.鸡滑液囊支原体耐药性研究目前,临床上常用的用于治疗支原体病的药物主要有大环内酯类(泰乐菌素、替米考星)、截短侧耳素类(盐酸沃尼妙林、泰妙菌素)、四环素类(盐酸多西环素、土霉素、强力霉素)和氟喹诺酮类(恩诺沙星),以及近几年逐渐得到广泛应用的林可霉素与大观霉素的组合药物。本研究选取上述9种常用的抗菌药物,对32株具有代表性的MS分离株进行体外药物敏感性试验,其最小抑菌浓度范围分别为<0.016～1 μg/mL、<0.016～1 μg/mL、<0.016～0.031μg/mL、<0.016～0.063 μg/mL、0.25～8 μg/mL、0.5～8 μg/mL、0.125～4 μg/mL、4～32 μg/mL和0.063～2 μg/mL。药敏试验结果表明:(1)所有分离株对盐酸大观霉素-林可霉素均敏感;(2)32株MS分离株对截短侧耳素类和大环内酯类抗生素敏感;(3)对四环素类抗生素不同药物的耐药性存在一定差异,所有分离株对强力霉素敏感,对于多西环素,除3株中度敏感外其余均为敏感,对于土霉素,除1株中度敏感外其余均为敏感;(4)所有分离株对恩诺沙星均耐药。为了进一步阐明MS对恩诺沙星耐药的机制,进一步对上述32株MS分离株4个氟喹诺酮类耐药相关基因进行PCR克隆与序列测定和分析,结果显示:parC基因中,32株MS分离株第85位存在I(Ile)-T(Thr)的替换;parE基因中,27株MS分离株第446位存在S(Ser)-P(Pro)的替换。这可能与氟喹诺酮类药物敏感性降低有关。本研究为MS的药物防控提供了参考依据。