当生物受到外界环境因素作用时，如高温、缺氧、毒物等，机体迅速启动高度程序化的热休克反应(heat shock response，HSR)，诱导合成许多热休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)。Hsps可作为“分子伴侣”，促进新蛋白质的合成、折叠、装配和运输，参与某些特殊调节蛋白的激活，以及蛋白信号系统如类固醇激素的活化，并参与蛋白降解和受损蛋白质的清除或恢复．按分子量的不同，Hsps可分为许多家族，其中热休克蛋白70(HSP70)家族是机体内含量最丰富Hsps，占细胞总蛋白质含量的1～2％，主要包括诱导型Hsp70(即Hsp72)和组分型Hsc70(又称Hsp73)。许多研究表明，Hsp70的表达升高或降低，导致机体细胞抵御外来环境有害因素的能力变化。Hsp70升高对环境危害因素如紫外线导致细胞损伤具有保护作用，但抑制Hsp70对细胞功能产生严重损害。Hsp70对细胞起着保护作用。苯并(a)芘(benzo(a)pyrene，BaP)是一种化学致癌物，广泛存在于生产和生活环境中。进入体内的BaP可在体内代谢成活性代谢产物BPDE(benzo(a)pyrene diolepoxide)。BPDE具有亲电子性，可与DNA亲核位点共价结合形成加合物，导致DNA损伤。BaP作用产生的DNA损伤修复，主要是由核苷酸切除修复(nucleotide-excision repair，NER)途径来完成。参与DNA损伤NER修复的主要核苷酸切除修复酶有XPA-G(xeroderma pigmentosum group A-G)、ERCC1(excision repair cross complementation group 1)等。本室早先研究揭示，在有多环芳烃职业暴露史的焦炉工人中，Hsp70水平较高的个体淋巴细胞DNA损伤轻微，Hsp70较低的个体DNA损伤较严重。Hsp70作为一种重要的保护性蛋白，可能与BaP所致DNA损伤及损伤修复相关酶的合成有关。本研究采用细胞转染和槲皮素处理的方法，分别使肺腺癌细胞A549的Hsp70过表达或抑制，建立Hsp70过表达细胞株与Hsp70抑制细胞模型。采用单细胞琼脂糖凝胶电泳(single cell agarose gel electrophoresis，SCGE)、Western-blot等方法，观察在BaP作用下，未转染A549细胞DNA损伤和Hsp70表达的关系。并用单细胞琼脂糖凝胶电泳方法观察在BaP作用下Hsp70过表达和抑制细胞DNA损伤作用的变化，研究Hsp70在DNA损伤中的保护作用。用实时荧光定量RT-PCR方法，研究Hsp70在BaP致细胞主要核苷酸切除修复酶mRNA表达变化中的作用。探讨Hsp70在BaP所致细胞DNA损伤修复中的作用，为防治环境危害因素BaP对机体的危害作用提供科学依据。本研究共分三部分。第一部分：Hsp70过表达与Hsp70抑制细胞模型的建立本部分首先采用含hsp70基因cDNA的pcDNA3.0/hsp70重组质粒对A549细胞进行细胞转染，建立稳定过量表达Hsp70的细胞株。以空载体质粒pcDNA3.0转染A549细胞作载体对照。用G418筛选细胞，并对3个含hsp70基因的重组质粒转染成功的细胞克隆进行免疫荧光细胞化学染色分析。挑选Hsp70表达荧光强度最高的细胞克隆，与未转染A549细胞和空载体质粒pcDNA3.0转染成功细胞一起，采用Western-blot对其Hsp70表达水平进行分析。结果发现重组质粒转染细胞A549/hsp70的Hsp70蛋白表达明显高于肺腺癌A549细胞中的表达水平(P＜0.01)，空载体质粒转染细胞A549/pcDNA Hsp70的表达与肺腺癌A549细胞相比无明显改变，建立了Hsp70过表达细胞A549/hsp70。为了建立Hsp70抑制的细胞模型，本研究采用槲皮素处理A549细胞。槲皮素(quercetin)是一种广泛存在的生物黄酮类物质，有较强的抗氧化能力，可以抑制某些肿瘤细胞Hsp70的合成，使细胞Hsp70表达降低。本研究用50、100、150、200μmol/L槲皮素处理A549细胞，37℃培养6h后，用MTT实验和Western-blot方法分别检测A549细胞活性和Hsp70表达水平。结果发现，随槲皮素浓度的增加，A549细胞的细胞活性呈下降趋势，并呈现一定的剂量-反应关系。随着槲皮素浓度的加大，Hsp70表达逐渐受到抑制。当槲皮素浓度达到100、150和200μmol/L时，Hsp70表达显著降低。综合考虑槲皮素对A549细胞活性及Hsp70表达水平的影响，本研究用150μmol/L槲皮素处理A549细胞6h抑制Hsp70的表达作为Hsp70降低的细胞模型。第二部分：Hsp70在苯并(a)芘致细胞DNA损伤中的保护作用为了研究在BaP作用下，Hsp70在DNA损伤中的作用，本研究首先将未转染A549细胞暴露于不同浓度的BaP中，观察DNA损伤与Hsp70表达之间的关系。结果表明，随BaP染毒浓度的增加，A549细胞的细胞活性呈下降趋势，并呈现一定的剂量-反应关系；与未染毒细胞组相比，10、50、100μmol/LBaP染毒组，细胞活性显著性降低(P＜0.05)；各染毒组(1、5、10、50、100μmol/L BaP)A549细胞的DNA损伤明显增强(P＜0.05)，同时在较高剂量(10、50、100μmol/L)的BaP作用下，BaP代谢产物明显抑制了A549细胞Hsp70的表达。进一步分析A549细胞Hsp70表达与DNA损伤之间的关系，发现Hsp70表达水平和DNA损伤程度呈负相关。本研究结果表明，BaP的代谢产物有可能通过一定程度抑制Hsp70的表达而导致细胞活性及DNA的损伤。为进一步研究Hsp70在BaP致A549细胞DNA损伤中的保护作用，本研究采用第一部分建立的Hsp70过表达和抑制细胞模型，将不同Hsp70表达的细胞暴露于不同浓度的BaP，用MTT和单细胞琼脂糖凝胶电泳实验等方法，直接观察Hsp70在BaP致DNA损伤中的保护作用。结果表明，在BaP高浓度染毒组(50μmol/L、100μmol/L)，Hsp70过表达细胞A549/hsp70细胞活性明显高于未转染A549细胞(P＜0.05)，表明Hsp70水平升高有助于增强细胞对BaP危害作用的耐受能力；槲皮素处理细胞A549/Quercetin与A549细胞相比，BaP各浓度组的细胞活性无显著性改变，可能是槲皮素抗氧化作用特性减弱了抑制Hsp70对A549细胞活性的影响。研究结果还表明，与未转染A549细胞相比，各染毒剂量组Hsp70过表达细胞A549/hsp70的DNA损伤程度均显著性降(P＜0.05)；而槲皮素处理细胞A549/Quercetin，在BaP超过5μmol/L时，与相同BaP染毒剂量的A549细胞相比，DNA损伤程度呈显著性升高(P＜0.05)，可能是槲皮素致A549细胞Hsp70降低后，细胞DNA对环境危害因素BaP的耐受能力降低，对细胞DNA的危害加剧。这表明Hsp70对BaP所致细胞DNA损伤有明显的保护作用。当BaP浓度达到5μmol/L时，与未染毒A549/hsp70细胞相比，Hsp70过表达细胞中观察到明显DNA损伤。由此表明，当BaP作用过度时，Hsp70对BaP致A549细胞DNA损伤的保护作用降低，但Hsp70过表达细胞的BaP作用阈值浓度相对提高。第三部分：Hsp70在苯并(a)芘致细胞主要核苷酸切除修复酶mRNA水平变化中的作用以上实验结果表明，Hsp70对苯并(a)芘所致DNA损伤具有一定的保护作用，在BaP作用下Hsp70过表达细胞A549/Hsp70细胞活性明显高于A549细胞，DNA损伤程度明显低于A549细胞。但对于Hsp70如何发挥保护DNA损伤作用的机制仍不清楚。BaP作用产生的损伤，主要是由核苷酸切除修复途径来完成。Hsp70在苯并(a)芘致细胞主要核苷酸切除修复酶mRNA表达变化中是否具有一定作用呢?本研究应用实时荧光定量RT-PCR方法，检测BaP作用下，A549、Hsp70过表达细胞A549/hsp70和槲皮抑制Hsp70细胞A549/Quercetin主要核苷酸切除修复酶mRNA的变化，探讨Hsp70在苯并(a)芘致细胞主要核苷酸切除修复酶mRNA水平变化中的作用。XPA mRNA结果表明，与相同剂量BaP处理A549细胞组相比较，在10μmol/LBaP作用下，A549/pcDNA和A549/hsp70细胞XPA mRNA水平无明显变化，A549/Quercetin细胞XPA mRNA水平显著降低(P＜0.05)；在50μmol/LBaP作用时，A549/pcDNA XPA mRNA水平无明显变化，A549/hsp70、A549/Quercetin细胞XPA mRNA水平均显著降低(P＜0.05)；在100μmol/L BaP作用时，A549/pcDNA、A549/hsp70、A549/Quercetin细胞XPA mRNA水平均显著升高(P＜0.05)。XPC mRNA结果表明，与相同剂量BaP染毒A549细胞组相比较，在5μmol/LBaP作用时，A549/pcDNA细胞XPC mRNA水平显著性降低(P＜0.05)，A549/hsp70和A549/Quercetin细胞XPC mRNA水平显著性升高(P＜0.05)；在10μmol/LBaP作用时，A549/pcDNA细胞XPC mRNA水平无明显变化，A549/hsp70和A549/Quercetin细胞XPC mRNA水平均显著性升高(P＜0.05)；在100μmol/LBaP作用时，A549/pcDNA和A549/Quercotin细胞XPC mRNA水平无明显变化，A549/hsp70细胞XPC mRNA水平显著升高(P＜0.05)。XPB mRNA结果表明，与相同剂量BaP染毒A549细胞组相比较，在10μmol/L BaP作用下，A549/pcDNA和A549/Quercetin细胞XPB mRNA水平显著降低(P＜0.05)，A549/hsp70细胞XPB mRNA水平显著升高(P＜0.05)；在100μmol/L BaP作用下，A549/pcDNA细胞XPB mRNA水平显著降低(P＜0.05)，A549/hsp70和A549/Quercetin细胞XPB mRNA水平均显著升高(P＜0.05)。XPG mRNA结果表明，与相同BaP处理A549细胞相比较，在10μmol/L BaP作用下，A549/pcDNA、A549/hsp70和A549/Quercetin细胞XPG mRNA水平均显著降低(P＜0.05)；在100μmol/L BaP作用下，A549/pcDNA和A549/hsp70细胞XPG mRNA水平均无明显改变，A549/Quercetin细胞XPG mRNA水平显著降低(P＜0.05)。XPF mRNA结果表明，与相同BaP处理A549细胞组相比较，在1、5、10、50μmol/L BaP作用下，A549/pcDNA、A549/hsp70和A549/Quercetin细胞XPF mRNA水平均显著降低(P＜0.05)；在100μmol/L BaP作用下，A549/Quercetin细胞XPF mRNA水平显著升高(P＜0.05)。ERCC1 mRNA结果表明，与相同BaP处理A549细胞组相比较，在1、5、10、50μmol/L BaP作用下，A549/pcDNA、A549/hsp70和A549/Quercetin细胞ERCC1 mRNA水平均显著降低(P＜0.05)；在100μmol/L BaP作用下，A549/pcDNA、A549/hsp70细胞ERCC1 mRNA水平降低(P＞0.05)，A549/Quercetin细胞ERCC1 mRNA水平显著升高(P＜0.05)。综上所述，本研究结果表明：(1)采用含hsp70基因cDNA的pcDNA3.0/hsp70重组质粒进行细胞转染以及用150μmol/L槲皮素处理A549细胞6h抑制Hsp70的表达，可以分别建立Hsp70过表达和Hsp70抑制的细胞模型。(2)一定剂量的BaP作用24h，它的代谢产物可能通过一定程度抑制A549细胞的Hsp70表达而导致DNA损伤，Hsp70表达水平与DNA损伤程度呈负相关。(3)在BaP作用下，与未转染的A549细胞相比，Hsp70过表达细胞A549/hsp70细胞活性明显提高，DNA损伤程度显著性降低；而槲皮素处理细胞A549/Quercetin DNA损伤程度呈显著性升高。这表明升高Hsp70水平有助于增强细胞对BaP危害作用的耐受能力，对BaP所致细胞DNA损伤有明显的保护作用。(4) Hsp70可能在BaP致核苷酸切除修复酶XPC、XPB mRNA水平变化中具有一定作用。尽管本研究已得到一些初步结果，但如下几个方面的问题尚有待于进一步深入研究：1、运用siRNA技术，特异性抑制Hsp70的表达，深入研究Hsp70在DNA与修复中的作用机理。2、对于Hsp70在DNA损伤修复中的研究需更加深入，如探讨Hsp70是否与核苷酸切除修复酶结合而参与NER修复。3、如何利用Hsp70在DNA损伤与修复中的保护作用来保护呼吸系统等免受环境危害因素BaP的损伤等。