WNT6基因低表达对MDA-MB-231细胞系生长增殖的影响

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目的:研究WNT6基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞系生长增殖的影响,分析WNT6基因在三阴性乳腺癌发生中的作用,为探讨三阴性乳腺癌发病的分子机制提供新的实验依据。方法:选取三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系为研究对象,针对WNT6基因,设计三个不同序列的特异性siRNA(siRNAl、 siRNA2、 siRNA3),另外设计不含目的基因的siRNA(scramble siRNA,scRNA);利用脂质体Lipofectamin2000将siRNA分别转染MDA-MB-231细胞系,运用RT-PCR和Western blot检测WNT6基因的表达情况,选择沉默效应最好的一组siRNA进行后续实验;以未转染的MDA-MB-231细胞系和转染scRNA的MDA-MB-231细胞系作为对照,运用RT-PCR和Western blot方法,检测MDA-MB-231细胞系WNT6基因在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法绘制细胞生长曲线,分析WNT6基因表达降低对MDA-MB-231细胞系生长、增殖的影响;软琼脂集落形成实验,观察各组细胞非停泊依赖性生长情况。结果:与未转染的MDA-MB-231细胞系比较,siRNAl、 siRNA2、 siRNA3分别转染MDA-MB-231细胞系后,RT-PCR检测WNT6基因mRNA的表达水平明显降低,分别降低约50%(p<0.01)、40%(p<0.05)和20%(p<0.05);Western blot检测结果显示:wnt6蛋白的表达水平也明显降低,分别比对照组降低约45%(p<0.01)、28%(p<0.05)和10%(p>0.05),表明siRNAl对WNT6基因的沉默效果最好,因此,后续实验选转染siRNAl的MDA-MB-231细胞系为实验组;以未转染和转染scRNA的MDA-MB-231细胞系作为对照组,通过RT-PCR、Western Blot检测分析WNT6基因在各组MDA-MB-231细胞系中的表达情况,结果表明,与对照组比较,实验组WNT6mRNA及蛋白表达水平均分别下调近50%和40%,差异具有统计学意义(p<0.05);scRNA组与未转染组比较差异无显著性(p>0.05)。MTT法绘制生长曲线发现,与对照组比较,转染48h后,实验组细胞生长速度受到明显抑制,细胞增殖率降低约48%;转染72h后,实验组细胞增殖率降低约49%,差异具有统计学意义(p<0.05);scRNA组与未转染组比较细胞增殖率差异无显著性(p>0.05)。细胞集落形成实验发现,实验组集落形成率较对照组降低,差异有统计学意义(p<0.05);scRNA组与未转染组相比,集落形成率无明显变化(p>0.05);结果表明,实验组较对照组,集落形成速度慢,数目少,克隆形成能力弱。结论: MDA-MB-231细胞系WNT6基因表达沉默,可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞系的生长与增殖。
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