肠道病毒71型（enterovirus71, EV71）与柯萨奇A16病毒是引起手足口病（hand foot and mouth disease, HFMD）的主要病原体。近年来手足口病在亚太地区的多次爆发，使当地青少年儿童的身体健康受到严重威胁。虽然手足口病发病后病情较温和且具有一定的自愈性，但如任由其发展也将导致严重的神经系统并发症，更为严重者可导致死亡。我国卫生部于2008年将手足口病列为法定报告的丙类传染病。迄今为止，防治手足口病的相关疫苗仍未上市。因此，研发广谱高效的手足口病疫苗意义重大。EV71病毒是一种非包膜的RNA病毒，隶属于小RNA病毒科（Picornaradae）家族，其颗粒的直径大小约30nm左右。EV71病毒的颗粒呈二十面体立体对称结构；其病毒衣壳由60组多聚蛋白所组成，每组多聚蛋白均含有4种衣壳蛋白（VP1-VP4）。有证据显示VP1-VP3蛋白位于正二十面体核衣壳的外表面，而VP4蛋白位于核衣壳的内部与RNA核心紧密连接。VP4蛋白长约70个氨基酸，N端豆蔻酰化。晶体结构X光衍射图分析表明：成熟的EV71病毒颗粒其立体结构与其他肠道病毒极其相似。本文的研究首先将EV71病毒C4亚型VP4蛋白N端前20个氨基酸的基因融合入乙肝病毒核心抗原（HbcAg）基因中，融合后的重组基因克隆至pET-22b (+)载体中。利用大肠杆菌表达系统分别表达HBc-N149蛋白以及HBc-N149-VP4-N20蛋白。IPTG诱导目的蛋白表达后利用Western-blot检测蛋白表达情况。诱导表达后的目的蛋白利用镍柱进行纯化。电镜观察结果显示，HBc-N149蛋白与HBc-N149-VP4-N20蛋白均可有效形成病毒样颗粒，且直径约为25-30nm。这一结果表明，将EV71病毒VP4蛋白N端前20个氨基酸插入HbcAg蛋白后并未改变其自组装形成病毒样颗粒的特性。为了研究重组HbcAg蛋白是否能产生针对VP4-N20的抗体，将纯化后的HBc-N149蛋白以及HBc-N149-VP4-N20蛋白通过肌肉注射的方式免疫雌性BALB/c小鼠。阴性对照组免疫PBS溶液。实验动物免疫后收集血清进行血清学相关检测。实验结果显示，重组HbcAg蛋白可以产生针对VP4-N20的抗体。为了验证包含有VP4-N20的重组HbcAg蛋白是否能产生针对EV71病毒的中和抗体，利用实验动物免疫后收集的血清进行体外中和实验。实验结果显示，HBc-N149-VP4-N20蛋白免疫组血清可以中和EV71病毒；HBc-N149蛋白免疫组血清未能中和EV71病毒。这一结果表明含有VP4-N20的重组HbcAg蛋白免疫实验动物后产生的抗体具有针对EV71病毒的中和活性。为了进一步验证抗HBc-N149-VP4-N20蛋白的血清是否能为实验小鼠提供针对EV71病毒的保护能力，进行了小鼠体内攻毒实验。实验动物选择1日龄BALB/c乳鼠。实验中选用针对乳鼠具有较高毒力的EV71病毒BrCr-TR株，通过腹腔注射病毒-血清混合物（血清分别选用免疫HBc-N149-VP4-N20蛋白的血清以及免疫HBc-N149蛋白的血清）、病毒-PBS溶液混合物。实验进行至第7天时，病毒-HBc-N149蛋白血清组乳鼠、病毒-PBS溶液组乳鼠开始出现行动迟缓、四肢乏力、四肢瘫痪等病症，有甚者出现死亡症状；第16天即实验结束时，病毒-HBc-N149蛋白血清组乳鼠存活率为40%，病毒-PBS溶液组乳鼠存活率为20%。反之，病毒-HBc-N149-VP4-N20蛋白血清组乳鼠存活率为90%。这一结果表明，重组HbcAg颗粒即HBc-N149-VP4-N20蛋白的免疫血清可以针对EV71病毒为新生乳鼠提供保护效力。进一步的研究中，利用肽库筛查实验确定了VP4-N20蛋白产生中和抗体的抗原决定簇表位。实验中肽库的设计原则为，分别从VP4-N20蛋白N端以及C端每次减少两个氨基酸。实验结果显示，当VP4-N20蛋白N端减少至第6个氨基酸时，或者C端减少至第10个氨基酸时，针对VP4-N20蛋白的免疫血清将不再和VP4-N20蛋白相结合。这一实验结果表明，VP4-N20蛋白产生中和抗体的抗原决定簇表位为其N端减少6个氨基酸、C端减少10个氨基酸后所剩多肽序列。本文的研究中，将EV71病毒C4亚型的VP4蛋白N端前20个氨基酸融合入HbcAg中且在大肠杆菌中表达。实验结果显示，融合目的蛋白在表达后可以自组装形成嵌合式病毒样颗粒，并且可以诱导产生针对病毒的有效中和抗体。后续试验中，通过肽库筛查确定了这一序列的抗原决定簇位点所在。实验结果最终表明，EV71病毒VP4蛋白中和表位的鉴定为研制广谱抗EV71预防性疫苗提供了新的思路和线索。