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研究背景:自噬作为一种细胞免疫防御机制受到广泛关注和研究。自噬与针对结核分枝杆菌的先天性和适应性免疫应答相关,其可通过参与调控溶酶体与吞噬体的融合,以及吞噬溶酶体的成熟过程,影响巨噬细胞对细菌的杀伤。有研究表明转录因子NRF2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)通过调节ROS的产生,参与巨噬细胞对感染结核分枝杆菌的杀伤。本研究旨在进一步探讨转录因子NRF2在巨噬细胞感染结核分枝杆菌自噬中的作用及其机制。方法:(1)通过RNA-seq技术对结核病人和健康人外周血中PBMC的线性RNA测序来检测NRF2的基因表达。然后利用实时荧光定量PCR(real-time quantitive PCR,q-PCR)技术对结核病人和健康人的外周血中PBMC的NRF2的测序结果进行验证。(2)建立由PMA(phorbol ester,佛波醇)诱导的M.tb感染THP-1来源巨噬细胞THP-1(a)模型。通过流式细胞分析仪和荧光显微镜检测活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)的变化水平;(3)利用q-PCR技术,检测M.tb感染巨噬细胞后,细胞内的NRF2和抗氧化物SOD-1、SOD-4、PPARA、NOX-1的基因转录水平;(3)利用蛋白质印迹(Western Blot,WB)检测M.tb感染巨噬细胞2h,4h,6h,12h和24h后NRF2和自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC-3)的表达水平。(4)再利用WB检测M.tb感染Brusatol预处理THP-1(a)后的NRF2和自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC-3)的表达水平。结果:(1)RNA-seq测序结果显示:与健康对照组相比,隐性结核病患者(LTB)NRF2线性RNA表达水平显著降低(p<0.01),活动性结核病患者(TB)轻度增高;q-PCR的结果表明,结核病人NRF2表达水平相对于健康人也呈现轻度增高趋势;(2)M.tb感染巨噬细胞组与未感染组相比较ROS产生水平水平显著升高(p<0.01);(3)M.tb感染THP-1(a)后,相对于THP-1(a)对照组,感染组细胞NRF2,SOD-4,SOD-1以及PPARA基因在转录水平都出现了不同程度的增高,其中SOD-4,SOD-1,PPARA表达水平差异具有统计学意义(p<0.05或P<0.01,n=3);(4)M.tb感染THP-1(a)6h前后,NRF2以及自噬相关蛋白(BECLIN-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC3)表达水平达到峰值;(5)Brusatol阻断NRF2活化后,M.tb感染THP-1(a)组的自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC3)的蛋白表达水平显著降低。结论:1.结核分枝杆菌感染对转录因子NRF2表达水平和活性有重要影响;2.NRF2通过调控胞内ROS水平影响巨噬细胞对感染结核分枝杆菌的自噬。