目的:氧化应激（Oxidative stress,OS）在多种疾病的发生机制中起着重要作用。在本课题组过去的研究中发现,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）发病中的关键蛋白之一―β-淀粉样肽（b-Amyloid peptide,Ab）可引起氧化应激水平升高;长期摄入过量氟化物可造成慢性氟中毒,导致机体全身性损伤,其主要损伤机制与氟诱导体内自由基过多有关。为了深入了解OS的致病作用,本文选择AD患者脑组织标本、β-淀粉样肽前体蛋白（b-Amyloid precursor protein,APP）高表达转基因小鼠、慢性氟中毒实验大鼠、经Ab处理的体外培养神经细胞,研究OS在该两种疾病中枢神经损伤中的作用及其分子发生机制。方法:1.AD研究:（1）研究对象:采用AD患者及对照组（非神经系统疾病）尸体解剖大脑海马及皮质颞叶区组织切片标本、APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠模型（APP高表达）及体外培养神经细胞（原代培养海马神经元和SH-SY5Y细胞系细胞）。（2）处理方法:用4月龄及8月龄转基因动物,经灌胃给予20 mg/kg白藜芦醇（Resveratrol,RSV）―一种沉默信息调节因子（Silent information regulators,SIRTs）激活剂、20 mg/kg苏拉明（Suramin）―SIRTs抑制剂、对照组动物给予生理盐水,处理时间为2个月。细胞模型采用0.5mmol/L Ab寡聚体（Aboligomers,AbOs）、10或50mmol/L RSV、200或300μg/mL Suramin、20mmol/L ZLN005及过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator 1α,PGC-1α）转染质粒分别或合并处理,孵育时间为24⁴8 h。（3）测定方法:用HE、尼氏染色、透射电镜及免疫组织化学方法检查人体或动物脑组织神经病理学形态变化;用免疫荧光或免疫组织化学方法检测SIRTs（SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5）在脑组织中的表达及定位;用CCK-8试验检测细胞的存活率;流式细胞技术或激光共聚焦显微镜检测体外培养细胞内凋亡或活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平;用ELISA试剂盒检测血清、脑脊液中α-可溶性分泌型APP片断（α-form soluble secreted APP,αAPPs）及脑组织中不可溶性Ab含量;用蛋白印迹（Western-blotting）、免疫荧光或免疫组化、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）检测试剂盒分别检测小鼠脑组织不同脑区和体外培养细胞中各种相关蛋白（SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5等）、mRNA表达水平及NAD+水平;用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力。2.慢性氟中毒研究:（1）研究对象:选择Sprague-Dawley（SD）大鼠。（2）处理方法:通过饮水加氟（50 mg/L,用氟化钠配制）及Vit E灌胃处理（50 mg/kg体重/天）复制慢性氟中毒动物模型及抗氧化剂处理动物模型,饲养时间为10个月。（3）测定方法:慢性氟中毒动物模型复制检查,包括脑重、氟斑牙程度、用氟电极方法测定尿氟及骨氟含量;采用生物化学方法测定氧化物阴离子(O^2.-)、脂质过氧化物（其代谢产物丙二醛）水平;用免疫组化方法测定胆碱能毒蕈碱样受体（Muscarinic acetylcholine receptors,mAChRs）蛋白表达水平;用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力。结果:1.AD部分:（1）人脑标本:结果显示,与正常人比较,AD患者大脑海马及颞叶皮质区SIRTs（SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5）表达均明显降低,并且出现大量的老年斑,老年斑的数量及分布与其的表达呈负相关的关系;（2）AD动物模型:结果显示,经过大量繁殖及基因型鉴定,AD动物模型成功建立;不同月龄段双转基因小鼠学习记忆能力较野生对照小鼠明显降低,脑重亦降低;较野生对照组比较,双转基因小鼠大脑神经元内尼氏小体明显减少,不同月龄双转基因小鼠大脑海马及皮质区均出现数量不等的老年斑,且其数量及分布程度随月龄增加而增加;电镜检查显示,不同月龄双转基因小鼠大脑神经元细胞核核膜局部有缺如,甚至核染色质边集,线粒体嵴和膜出现不同程度融合、断裂、消失;应用RSV处理双转基因小鼠后,其学习记忆能力及脑组织病理学变化明显改善,而Suramin则可进一步加重这些改变。双转基因小鼠海马及皮质区SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5蛋白及mRNA表达均出现不同程度降低,其在大脑海马及皮质区均有分布;同时,双转基因小鼠海马及皮质区PGC-1α、OGG1、α7 nAChR、Syn及SNAP25蛋白表达明显降低,Apo E、Caspase3蛋白表达明显升高;另外,α-分泌酶（ADAM10）及β-分泌酶（BACE2）蛋白表达出现不同程度降低,而β-分泌酶（BACE1）明显升高;而上述改变均可被RSV逆转,动物老年斑明显减少。双转基因小鼠血清及脑脊液中αAPPs含量明显降低;脑组织中不可溶性Aβ水平明显增加,NAD+含量明显降低;而经过RSV处理的双转基因小鼠αAPPs及NAD+含量明显升高,不可溶性Aβ水平明显降低,应用Suramin则出现相反的作用。双转基因小鼠血清、脑组织及线粒体中OS水平与抗氧化酶水平明显升高或降低;应用RSV后,其可降低OS,升高抗氧化酶活性,而Suramin则出现相反的作用。（3）细胞模型:结果显示,原代培养的大鼠海马神经元纯度约达到83%左右,PGC-1α沉默的海马神经元及SH-SY5Y细胞中PGC-1α蛋白表达水平均明显低于野生对照组细胞;加AbOs处理后,神经元内SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5蛋白及mRNA表达均出现不同程度降低;应用RSV预处理神经元后,SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5表达明显升高,且RSV可明显清除进入细胞内的AbOs,而Suramin则可进一步加重AbOs的毒性作用;另外,AbOs处理神经元后,细胞内PGC-1α、OGG1、α7 nAChR蛋白表达明显降低,Apo E、Caspase3蛋白表达明显升高;ADAM10及BACE2蛋白表达降低,而BACE1蛋白表达明显升高,RSV预处理细胞后,其可抑制上述改变。AbOs可以使神经元内NAD+水平明显降低,细胞凋亡,细胞内ROS及OS水平明显升高,而细胞及线粒体内抗氧化酶含量明显降低;RSV与处理细胞后,可逆转上述改变,而Suramin则加重上述改变。另外,随着PGC-1α的沉默,SIRT1不能抑制Apo E的表达;而激活PGC-1α后,即使抑制SIRT1的表达,也能调控Apo E的表达。2.慢性氟中毒部分:结果显示,染氟成年大鼠出现不同程度的氟斑牙,尿氟及骨氟含量高于对照组,脑重未见明显变化,学习记忆能力明显降低,同时脑组织M₁、M₃受体蛋白表达水平均低于对照组;脑组织O^2·-及MDA水平明显升高。经Vit E处理的慢性氟中毒大鼠上述毒性改变明显减弱。相关分析结果发现,随着大鼠学习记忆能力降低,M₁、M₃受体蛋白表达呈降低趋势,两两存在正相关关系。结论:（1）AD患者脑组织、APP高表达转基因小鼠脑组织及经AbOs的神经细胞中OS水平升高,SIRTs表达的降低,可能是导致老年斑大量聚集的原因之一。（2）RSV通过增加SIRTs的表达,减少AbOs诱导的细胞毒性作用,其机制可能涉及SIRTs激活后调控其下游的一系列蛋白,降低线粒体自由基和ROS产生,减少细胞脂质过氧化水平,提升抗氧化酶活性,减少Apo E的改变,抑制线粒体DNA损伤,从而减少细胞凋亡,进而降低细胞老化所引起的学习记忆能力的改变。（3）SIRTs激活后通过刺激α7 nAChR的表达,活化ADAM10,增强APP非淀粉代谢途径,促进sAPPα分泌,从而减少Ab在大脑中的沉积。（4）慢性氟中毒大鼠脑组织中OS水平升高,mAChR M₁及M₃受体蛋白表达水平降低,MDA及O^2·-水平升高,受体水平减低与OS水平的上升有显著性负性相关,这些改变可能是氟中毒大鼠学习记忆能力降低的机制;抗氧化剂对慢性氟中毒脑组织损伤有一定抑制作用。（5）OS在AD及慢性氟中毒中枢神经系统病理损伤机制中有重要作用,抗氧化剂处理或提高抗氧化水平可对抗过量Ab或氟化物引起的神经损伤。