Ⅰ多种分析技术对白芷硫磺熏蒸的创新性应用研究中药白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷A. dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f var. formosana (Boiss.) Shan et Yuan的干燥根,性温味辛,归胃、大肠、肺经,具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效,主要用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、疮疡肿痛等症。白芷的传统产地加工方法为硫磺熏蒸法。该法可达到药材快速干燥,防虫防霉的效果。但大量研究表明,硫磺熏蒸法虽然解决了药材干燥和防虫防霉等问题,但造成白芷有效成分含量下降,药效活性降低,硫残留明显增加,使药材质量受到严重影响,患者的临床用药安全受到威胁。因此,鉴别硫磺熏蒸白芷,评价白芷药材及市售饮片的质量,完善其质量控制显得尤为重要。本论文采用高速逆流色谱法(HSCCC)高效地分离白芷中的化学成分,为后续定性定量研究提供对照品；采用近红外光谱法(NIR)建立硫磺熏蒸白芷快速鉴别法及欧前胡素定量模型；并采用核磁共振谱法(NMR)和高效液相色谱法(HPLC)全面分析白芷药材硫熏前后的化学成分变化,明确硫磺熏蒸法对白芷中化学成分的影响,并对市售饮片进行质量评价。此外,为了避免硫磺熏蒸法的不良影响,本论文研制了两种新型硫磺熏蒸替代技术,以保证产地加工过程中白芷的药材质量。主要研究内容如下：基于HSCCC技术,首次配制正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水三相溶剂体系(4:3:4：4,v/v),且首次使用该三相溶剂体系的上相(UP)／下相(LP)分离新鲜白芷石油醚萃取物(新鲜白芷：3.4kg;石油醚萃取物：18.7g[得率：0.55%]),一次性分离得到8个香豆素类化合物：水合氧化前胡素(B1,18.9 mg,纯度>98.0%)、白当归素(B2,8.4mg,纯度>98.0%)、白当归脑(B3,33.5 mg,纯度75.6%)、佛手柑内酯(B4,10.3mg,纯度>98.0%)、氧化前胡素(B5,29.7 mg,纯度>98.0%)、欧前胡素(B6,78.6 mg,纯度>98.0%)、珊瑚菜内酯(B7,40.4mg,纯度>98.0%)和异欧前胡素(B8,30.6 mg,纯度93.3%),其中,首次通过HSCCC分离得到白当归脑(B3)。对比新鲜白芷石油醚萃取物HPLC图谱和HSCCC分离图谱,发现HPLC图谱中B3的保留时间在B4之后,而HSCCC分离图谱中B3的保留时间在B4之前,说明B3可能与HPLC色谱柱之间存在较强的吸附作用;HPLC图谱中B3(43.1 min)和B5(43.6 min)的保留时间接近,而在HSCCC条件下,由于B3和B5的分配系数分别为0.48和0.94,故可达到较好的分离效果。基于NIR技术,首次建立快速鉴别硫磺熏蒸白芷的方法及白芷中欧前胡素的定量模型。快速鉴别硫磺熏蒸白芷的方法为：将所有29批非硫磺熏蒸白芷药材和29批硫磺熏蒸白芷药材的原始NIR图谱经21点平滑后进行一阶导数求导,结合矢量归一化法进行预处理,在8806.0-3811.0 cm-1光谱区段,采用OPUS/INDENT定性分析软件中的Ward’s Algorithm法进行聚类分析。该方法成功将非硫磺熏蒸和硫磺熏蒸白芷药材聚为两类,实现硫磺熏蒸白芷的快速鉴别。白芷中欧前胡素的定量模型为：随机选择30批白芷药材用作定量模型的建立(22批校正集,8批验证集)。将22批校正集样品的原始NIR图谱经一阶导数+减去一条直线法进行预处理,选择6102.2-5446.3 cm-1光谱区段,前10个主成分,采用OPUS/QUANT定量分析软件中的偏最小二乘法,结合HPLC法测定欧前胡素的含量,建立最优校正定量模型。通过该定量模型计算得8批验证集的平均回收率为102.5%,说明该定量模型可实现准确定量,具有较高的预测精度。基于NMR技术,首次测定白芷石油醚提取物1H-NMR指纹图谱。对15批非硫磺熏蒸白芷药材和15批硫磺熏蒸白芷药材石油醚提取物的1H-NMR图指纹谱进行分析,结果表明：非硫磺熏蒸和硫磺熏蒸白芷药材石油醚提取物1H-NMR指纹图谱存在明显差异,即硫磺熏蒸前后白芷的化学成分有明显差异,其中差异明显的10个特征信号峰是：δ3.20-3.25 ppm、δ3.60-3.70 ppm、δ3.90-3.95 ppm、 δ4.10-4.25 ppm、δ4.40-4.66 ppm、δ6.24-6.42 ppm、δ7.00-7.10 ppm、 δ7.10-7.25 ppm、δ7.60-7.70 ppm和δ8.10-8.28 ppm。通过与欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素、氧化前胡素、佛手柑内酯和白当归脑对照品1H-NMR图谱对比,结果表明：硫磺熏蒸白芷药材中欧前胡素等6个对照品的相对积分面积降低,推测硫磺熏蒸法影响白芷中欧前胡素等对照品的含量。利用主成分分析(PCA)法,以10个特征信号峰的相对积分面积为变量,进一步描述非硫磺熏蒸和硫磺熏蒸白芷药材的差异,结果表明：非硫磺熏蒸白芷药材和硫磺熏蒸白芷药材明显聚为两类。1H-NMR-PCA结果与NIR聚类结果具有一致性,说明两种方法均可用于鉴别硫磺熏蒸白芷样品。基于HPLC技术,首次评价全国市售白芷饮片的质量。色谱条件如下：Dikma色谱柱(Diamonsil(R)-C18,250mm×4.6 mm,5μm),柱温35℃,乙腈-水梯度洗脱,检测波长210-800nm范围内的最大绘图(Max Plot),分别测定18批非硫磺熏蒸白芷药材、18批硫磺熏蒸白芷药材,及31批市售白芷饮片的HPLC指纹图谱,并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行相似度分析。结果表明：18批非硫磺熏蒸白芷药材的HPLC指纹图谱相似,相似度数值为0.92-0.98,具有质量一致性；18批硫磺熏蒸白芷药材的HPLC指纹图谱相似,相似度数值为0.88-0.96,具有质量一致性。但非硫磺熏蒸和硫磺熏蒸白芷药材的HPLC指纹图谱有明显差异,该结果与白芷石油醚提取物1H-NMR指纹图谱的分析结果一致,表明：硫磺熏蒸前后白芷的化学成分有明显差异。31批市售白芷饮片的HPLC指纹图谱有差异,其中,2号(湖北)和15号饮片(宁夏)的HPLC指纹图谱与非硫磺熏蒸白芷药材的HPLC指纹图谱相似,其他29批饮片的HPLC指纹图谱与硫磺熏蒸白芷药材的HPLC指纹图谱相似。此外,通过计算相似度b/相似度c(相似度b：与非硫磺熏蒸药材对照图谱比对的相似度数值；相似度c：与硫磺熏蒸药材对照图谱比对的相似度数值),推断各批市售饮片是否经过硫磺熏蒸。当该比值>1时,说明该批市售饮片与非硫磺熏蒸药材对照图谱的相似性更好,可能未经过硫磺熏蒸加工处理。在31批饮片中,除2号(1.08)和15号饮片(1.24)外,其他29批市售饮片的相似度比值<1,该相似度分析结果与HPLC图谱分析结果具有一致性,2号和15号饮片可能未经硫磺熏蒸处理。随后,通过本论文中建立的硫磺熏蒸白芷NIR技术快速鉴别法,确定2号和15号市售饮片为非硫磺熏蒸品,其他29批市售饮片为硫磺熏蒸品,验证了HPLC图谱和相似度分析结果,完成市售饮片的定性分析。基于HPLC技术,首次同时对白芷中9种香豆素类化合物定量,并首次同时考察硫磺熏蒸法对欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素含量的影响。按照峰面积归一化法对31批市售白芷饮片中的9种香豆素类化合物进行定量,结果表明：白当归素、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素在全部饮片中均被检测到；茴芹内酯仅在非硫磺熏蒸饮片(2,15号)中被检测到,花椒毒素、佛手柑内酯、白当归脑和氧化前胡素在非硫磺熏蒸饮片和部分硫磺熏蒸饮片中被检测到。对白当归素、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素进行统计学分析,发现在非硫磺熏蒸和硫磺熏蒸饮片中,白当归素的含量无明显差异(p>0.05),而欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素的含量有明显差异(p<0.05)。进一步测定18批非硫磺熏蒸白芷药材和18批硫磺熏蒸白芷药材中欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素含量,结果表明硫磺熏蒸法分别使欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素含量下降39.20%、34.91%和35.47%,造成药材质量下降。该定量结果与1H-NMR分析中硫磺熏蒸白芷药材中6种对照品相对积分面积的下降具有一致性。通过上述多种技术从多方位、多角度分析硫磺熏蒸法对白芷的影响。1H-NMR-PCA结果与NIR聚类结果具有一致性,表明硫磺熏蒸前后白芷的化学成分有明显差异；1H-NMR和HPLC分析结果具有一致性,表明硫磺熏蒸法造成白芷中欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素含量的降低。其中,NIR技术方便快捷,且无化学污染；1H-NMR所需的样品量更少,分析时间更短；HPLC法在定量方面具有方便、直观和准确的优势。鉴于以上分析结果,为了避免硫磺熏蒸法对白芷药材质量造成的不良影响,本论文研制了两种新型硫磺熏蒸替代技术,并对两种技术干燥的药材进行外观鉴别、出药率测定、醇浸出物测定和欧前胡素含量测定,以及对药材贮存12个月后的欧前胡素含量进行了测定。两种技术干燥的白芷药材平均出药率分别为24.79%和25.17%,醇浸出物平均含量分别为19.89%和20.43%,欧前胡素平均含量分别为0.18%和0.15%,药材贮存12个月后欧前胡素平均含量分别为0.17%和0.15%。以上指标均符合2010版《中国药典》的质量标准要求,且与自然干燥药材的各项指标相比无明显差异(平均出药率为24.26%,醇浸出物平均含量为18.97%,欧前胡素平均含量为0.15%,药材贮存12个月欧前胡素平均含量0.14%),表明这两种新型硫磺熏蒸替代技术干燥的药材均为合格品。根据以上数据说明该技术可替代硫磺熏蒸法,具有广阔的应用价值。Ⅱ β-谷甾醇标准样品的研制β-谷甾醇是一种广泛存在于植物中的植物甾醇,常见于多种中药和可食用植物中。临床药理研究发现β-谷甾醇具有降低低密度脂蛋白含量,及抗细胞增殖等药理活性。基于国际标准导则(ISO) 35:2006 (GB/T 15000.3-2008),在国家质量监督检验检疫总局行业科研专项“天然产物标准样品示范性研制和技术规范化研究”项目中,考虑到β-谷甾醇是植物中的一种主要功能性化合物,可用于药品和功能性食品的生产与开发,因此制备大量纯度较高的β-谷甾醇,将其作为标准样品用于药用植物和农产品的定量评价。本研究中的β-谷甾醇粗品来源于白芥Sinapis alba L.(Cruciferae)种子,采用色谱甲醇重结晶纯化,制备得到的β-谷甾醇晶体为白色,柔软柱状晶体。测定β-谷甾醇晶体的元素分析、红外吸收光谱、核磁共振谱和X-射线单晶衍射。根据测定的数据,确定该晶体为C29H50O·1/2H2O,同时确定其立体结构。建立高效液相—蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测方法,检测条件为：HPLC色谱仪(ELSD检测器)；Kromasil 100-5C18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm);流动相为甲醇-水(99/1,v/v)；流速1.0 mL/min;柱温30℃；ELSD条件：漂移管温度80℃,载气流速为1.6 mL/min;样品处理：称取样品1 mg(每瓶装10 mg),加色谱甲醇溶解,并定容至5 mL容量瓶中,过0.45μm微孔滤膜,即得0.2 mg/mL的样品溶液；进样量10μL；纯度计算方法为峰面积归一化法,测定制备的β-谷甾醇纯度在95%以上。将制备好的β-谷甾醇标准样品用棕色瓶分装,每瓶10 mg,共300瓶,编号后置0-8℃下密封保存。根据ISO Guide 352006/GB/T 15000-2008标准样品工作导则(3)《标准样品定值的一般原则和统计方法》第7章均匀性研究的要求对β-谷甾醇进行均匀性检查,采用F检验确定β-谷甾醇的均匀性数据符合正态分布。β-谷甾醇的F值为1.94,小于F临界值(2.22),表明该样品是均匀的。采用稳定性试验和加速稳定性试验考察β-谷甾醇的稳定性。稳定性试验方法如下：取样品,模拟市售包装,在0-8℃条件下放置2年,分别于0、1、2、3、6、9、12、18和24个月时取3个样品,测定其纯度,并采用t检验和F检验对稳定性试验获得的数据进行分析。由于t检验的斜率绝对值为0.0014%,小于0.010%(t因子[2.37,v=8,P=0.95]和斜率相关不确定度的乘积),故斜率不显著,未观测到不稳定性；F值为0.12,小于F临界值(5.59),因此可确定稳定性条件下,β-谷甾醇在24个月内是稳定的。根据2010版《中国药典》中加速稳定性试验方法进行考察,取样品,模拟市售包装,在温度为40℃±2℃、相对湿度为75%±5%的条件下放置6个月,分别于0、1、2、3和6个月时取3个样品,测定其纯度,分别采用t检验和F检验对加速稳定性试验获得的数据进行分析。由于t检验的斜率绝对值为0.0077%,小于0.067%(t因子[3.18,v=3,P=0.95]和斜率相关不确定度的乘积),故斜率不显著,未观测到不稳定性；F值为0.13,小于F临界值(7.71),因此可确定加速条件下,β-谷甾醇在6个月内是稳定的。因此,我们将β-谷甾醇标准样品的有效期定为2年,高温高湿条件下β-谷甾醇标准样品的有效期定为6个月。根据ISO Guide 35:2006/GB/T 15000-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》,选取了8家实验室进行联合定值,采用HPLC-ELSD测量纯度。采用格拉布斯法(Grubb’s)检验各个实验室内数据的异常值,结果显示β-谷甾醇的8家实验室内数据的Grubb’s统计量G(1.073,1.231,1.278,1.730,1.354,1.780,1.497,1.648)均小于G0.99(6)(1.944)和G0.95(6)(1.832),因此8家实验室的数据全部有效,没有异常值。随后采用峰度法检验各家实验室数据的正态性,结果表明8家实验室数据得到的bk值(2.66,1.49,1.28,2.62,1.77,2.77,1.81,2.47)均小于临界值(3.70),因此均未检测出异常值。根据GB/T 15000.3-2008标准规定,定值结果由标准值和不确定度组成。标准样品特性标准值的测量不确定度(UCRM, 0.28%)由测定得到的标准值不确定度u(X)(0.01%)、均匀性检验的不确定度ubb(0.05%)和稳定性检验的不确定度ults(0.13%)组成。依据全部测定结果,β-谷甾醇标准样品的特性标准值和扩展不确定度分别为95.41%和0.28%。