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研究目的食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在癌症发病率中排名第五,其中绝大多数（>90%）为食管鳞癌,患者临床疗效及总体生存欠佳,病死率高居全癌种第三位。目前食管鳞癌的一线化疗方案以铂类和氟尿嘧啶或紫杉醇联用为主,而顺铂则是食管鳞癌患者临床最常用铂类药物。顺铂进入细胞后能够与DNA嘌呤残基上的N7反应形成加合物,造成DNA损伤并诱发肿瘤细胞发生凋亡,从而发挥其抗癌作用。但部分患者对顺铂的天然或获得性耐药导致其总体临床化疗效果不佳,这也是造成食管癌患者死亡率居高不下的主要原因之一。肿瘤细胞中DNA损伤修复能力及下游凋亡信号转导失调均可导致顺铂耐药的发生。核苷酸切除修复途径是识别并修复顺铂导致的DNA损伤的主要途径,该途径被激活后能够进一步激活毛细血管扩张性共济失调Rad3相关激酶（Ataxia telangiectasia and Rad3-related,ATR）。ATR属于磷酸肌醇3激酶相关蛋白激酶家族,在阻滞细胞周期,稳定复制叉,介导DNA损伤修复应答方面均发挥重要作用。前期研究结果显示,作为一种ATR抑制剂,AZD6738能够增强胰导管腺癌及非小细胞肺癌的化疗敏感性,但其对食管鳞癌的作用目前尚不清楚。本研究旨在探究AZD6738对食管鳞癌细胞的顺铂增敏作用和机制,为应对临床铂类耐药提供科学依据。研究方法1.通过体外及体内药敏实验检测AZD6738对顺铂的增敏作用:（1）通过CCK-8实验检测多种食管鳞癌细胞对顺铂或ATR抑制剂AZD6738的药物敏感性,使用Graph Pad Prism分别计算出其IC50值。（2）通过CCK-8实验检测多种食管鳞癌细胞对AZD6738与顺铂联合作用的药物敏感性,计算IC50值并与顺铂单药的IC50值进行比较,评估AZD6738对顺铂的增敏效果。（3）小鼠体内药敏实验:将食管鳞癌顺铂耐药细胞株KYSE150接种于裸鼠背部皮下,测量瘤块大小达到250mm3后分组给药:生理盐水组、顺铂单药组、AZD6738单药组、顺铂与AZD6738联用组。检测、比较各组瘤块生长速率,全部实验周期结束时检测、比较各组终点瘤块大小和重量,从而评估AZD6738在小鼠体内对顺铂的增敏效果。2.通过建立顺铂耐药细胞株及药敏实验检测AZD6738对获得性顺铂耐药的逆转作用:（1）通过对顺铂敏感的KYSE510和TE10细胞低浓度顺铂连续给药,建立食管鳞癌细胞获得性顺铂耐药株510R和TE10R。通过CCK-8实验检测亲本细胞510P和TE10P和耐药细胞510R和TE10R对顺铂的药物敏感性,分别计算出其IC50值;通过克隆形成实验使用低浓度顺铂培养基验证耐药细胞的耐药性。（2）通过CCK-8实验检测510R和TE10R细胞对AZD6738与顺铂联用的药物敏感性,计算IC50值并与顺铂单药的IC50值进行比较,评估AZD6738对获得性顺铂耐药株的增敏效果。3.通过分子/细胞生物学实验探讨食管鳞癌细胞中AZD6738对顺铂增敏的作用机制:（1）Western Blot及彗星实验,在KYSE150细胞中检测AZD6738对顺铂造成的DNA损伤修复的影响。（2）Western Blot和流式细胞术在KYSE150细胞中检测AZD6738对顺铂诱导凋亡的影响。4.通过网络药理学及结构生物学等虚拟研究方法预测AZD6738的潜在新靶点并利用分子生物学方法对潜在靶点进行初步鉴定:（1）利用网络药理学方法预测AZD6738潜在作用靶点并进行GO/KEGG富集分析;根据富集结果,通过Western Blot检测通路中的关键分子在AZD6738加药处理后的磷酸化水平变化,以期鉴定AZD6738的潜在新靶点（p70 S6K）。（2）通过分子对接技术评估、预测AZD6738与p70 S6K结合的可能性及潜在结合位点。5.通过分子生物学实验对上述虚拟研究及靶点初步鉴定结果进行验证:（1）在KYSE510细胞中通过Western Blot检测顺铂单药或顺铂和AZD6738联用情况下p-p70 S6K T389位点磷酸化水平变化。（2）通过Western Blot检测si RNA敲降ATR及其下游效应蛋白Chk1后p-p70S6K T389的水平变化,从而判断ATR/Chk1与p-p70 S6K T389位点磷酸化水平的相关性。6.通过体外及体内实验进一步探讨食管鳞癌细胞中AZD6738对顺铂增敏作用的分子机制:（1）通过Western Blot检测对比510P和510R,TE10P和TE10R细胞中p70 S6KT389位点的磷酸化水平变化;并进一步检测对比KYSE150天然耐药株和510R获得性耐药株经顺铂单药或顺铂与AZD6738联用处理后p70 S6K T389位点的磷酸化水平变化情况。（2）通过Western Blot检测顺铂单药或顺铂与AZD6738联用后p70 S6K下游凋亡相关蛋白BAD Ser136位点的磷酸化水平变化。（3）通过体外和体内实验检测敲降p70 S6K后食管鳞癌细胞对顺铂敏感性的变化情况。研究结果1.不同的食管鳞癌细胞株对顺铂的敏感性差异较大:KYSE150及KYSE30细胞的顺铂IC50值分别为24.39μM和14.76μM,具有较强的耐药性;而KYSE450,KYSE510和TE10细胞的顺铂IC50值均小于10μM,对顺铂较为敏感。AZD6738能够显著降低KYSE150和KYSE510的顺铂IC50值,降低倍数分别为14.8和3.7。小鼠体内药敏实验结果显示,顺铂和AZD6738双药联用组肿瘤生长速度和瘤块体积明显小于顺铂单药组。2.成功建立食管鳞癌获得性顺铂耐药细胞株510R和TE10R,其IC50值（18.05μM和27.87μM）明显高于亲本细胞510P和TE10P的IC50值（5.49μM和9.71μM）;克隆形成实验进一步验证了510R和TE10R细胞的顺铂耐药性。AZD6738能够显著降低510R和TE10R细胞的IC50值,逆转食管鳞癌细胞的获得性顺铂耐药。3.与顺铂单药相比,低剂量AZD6738与顺铂联用能够明显抑制食管鳞癌细胞中顺铂诱导的ATR活化（T1989磷酸化）水平,显著提高H2A.X S139位点的磷酸化水平和彗星实验拖尾长度;同时细胞凋亡比例显著增加并伴有PARP剪切带增强。提示AZD6738能够抑制顺铂引起的ATR激酶活化、干扰DNA损伤修复,从而增加顺铂诱导的食管鳞癌细胞凋亡。4.网络药理学及生物信息学分析结果显示,AZD6738与细胞凋亡、PI3K/Akt、MAPK、细胞周期等生物学过程及信号通路密切相关。通过对上述信号通路关键因子的活性（磷酸化水平）进行检测,发现AZD6738能够影响p70 S6KT389位点的磷酸化水平。分子对接结果提示,p70 S6K与AZD6738具有较强的结合能力,结合能为8.644 kcl/mol,是AZD6738的潜在新靶点。5.在食管鳞癌细胞中,AZD6738能够抑制顺铂诱导的p70 S6K T389位点磷酸化水平升高,但这一抑制作用并不依赖于ATR/Chk1激酶活性。6.在获得性顺铂耐药细胞株510R和TE10R中,p70 S6K T389位点的磷酸化水平显著高于其相应的亲本细胞。AZD6738既可抑制天然耐药株KYSE150也能够抑制获得性顺铂耐药株510R中由顺铂诱导的p70 S6K T389位点的磷酸化水平升高。进一步研究结果提示,AZD6738可通过抑制顺铂诱导的p70S6K激酶活化（T389磷酸化）干扰促凋亡相关蛋白BAD S136位点的磷酸化,促进顺铂诱导的细胞凋亡。另外,体外和体内实验结果均显示,生物学敲降p70 S6K能够增加食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性。结论1.ATR抑制剂AZD6738对食管鳞癌天然顺铂耐药株和获得性顺铂耐药株均有显著的增敏顺铂的作用。2.ATR抑制剂AZD6738能够抑制食管鳞癌细胞ATR激酶活性,增加顺铂造成的DNA损伤;同时,AZD6738还能通过非ATR途径抑制顺铂诱导的p70 S6K活化（T389位点的磷酸化水平升高）,进而抑制BAD S136位点的磷酸化。因此,AZD6738能够通过以上两种方式促进顺铂诱导的细胞凋亡,从而增加食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性。3.p70 S6K作为AZD6738在食管鳞癌细胞中的潜在新靶点,在调控顺铂敏感性方面发挥重要作用。