井冈霉烯胺属于C₇N氨基环醇类化合物,作为糖苷水解酶抑制剂的核心结构,是II型糖尿病治疗药物阿卡波糖和伏格列波糖的共同前体,对糖尿病及相关疾病药物研发具有重要意义。目前井冈霉烯胺主要通过化学合成与微生物半合成法进行生产,具有步骤繁琐、产率低、成本较高等缺点,其高效合成一直是化学及生物合成的热点。实验室前期以合成生物学“设计”理念,借助井冈霉素生物合成途径中ValA、ValD和ValK催化合成的井冈霉烯酮前体,通过考察异源氨基转移酶的立体选择性和催化效率,实现了井冈霉烯胺的设计合成。本研究对吸水链霉菌5008（Streptomyces hygroscopicus 5008,以下简称S5008）井冈霉烯酮磷酸化酶基因valC敲除菌株S5008ΔvalC的代谢网络及发酵产物进行了系统分析,考察了井冈霉烯胺设计途径中前体化合物井冈霉烯酮及氨基供体谷氨酸和谷氨酰胺的供应能力,对其氮代谢途径的谷氨酸脱氢酶（SHJG₇666）和谷氨酰胺合成酶（SHJG₃687）进行酶学性质表征,确认了SHJG₇666和SHJG₃687的催化功能,为通过基因过表达等代谢工程手段增加氨基供体供应、提高工程菌井冈霉烯胺产量奠定了基础。同时,本研究考察了valAp、ermEp*、kasOp*和SF14等四种不同来源的启动子对外源氨基转移酶VarB在S5008ΔvalC底盘细胞中表达的调控作用,转录分析结果显示,候选启动子对varB的转录强度依次为kasOp^*>SF14>ermEp^*>valAp,在kasOp*强启动子存在状态下,氨基转移酶varB基因的转录水平是无启动子状态下的10⁵倍。为进一步考察外源氨基转移酶与底盘代谢途径的适配性,本研究构建了基因置换系统,实现了外源氨基转移酶基因varB、kasOp*-varB和井冈霉烯酮磷酸化酶基因valC在基因组上的原位替换;并考察了在基因组原始valC启动子状态及kasOp*强启动子存在状态下,该位置上varB及其下游基因valD转录水平。qRT-PCR结果显示,在kasOp*强启动子存在状态下,氨基转移酶varB基因的转录量是原始valC启动子状态下的3⁴倍,且对下游基因valD的表达无较大影响。基因双交换菌株S5008ΔvalC::varB（in situ）培养5天后发酵产物经HPLC检测,结果显示井冈霉烯胺的产量为160.3μg/L。综上所述,本研究通过对井冈霉烯胺设计合成途径中前体供应、外源基因与底盘细胞适配性进行了系统性研究,以期优化设计途径的代谢流,提升代谢通量,实现目标产物井冈霉烯胺的高效合成。