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第一部分白藜芦醇对人膀胱癌T24细胞增殖和细胞周期的影响目的研究白藜芦醇在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞增殖和细胞周期的影响及其可能机制。方法采用MTT法观察不同浓度白藜芦醇(0,25,50,100,150,200和250μM)在不同的作用时间(12,24,和48h)后,T24细胞增殖的变化。收集不同浓度白藜芦醇(0,50,100,150和200μM)作用24小时后的T24细胞,碘化丙锭(PI)染色后经流式细胞仪检测膀胱癌T24细胞的周期变化。Western blotting法检测与细胞周期调节相关蛋白cyclin D1、CDK4和WAF-1/p21在不同浓度白藜芦醇(0,50,100,150和200μM)作用24小时后的表达。结果1.白藜芦醇能明显抑制T24细胞增殖,并随药物浓度升高(0-250μM)和作用时间的延长(12-48h)而抑制作用增强,呈显著浓度和时间依赖性。2.在白藜芦醇(0-250μM)作用12h后,T24细胞生存率范围为49.8%-97.0%,在作用24和48 h后,细胞生存率范围分别为27.7%-98.0%和20.6%-95.7%。3.经流式细胞仪检测,不同浓度白藜芦醇(50,100,150和200μM)作用24小时能明显使处于G1期T24细胞增多,细胞明显阻滞于G1期。4.白藜芦醇(0,50,100,150和200μM)作用24小时后,随着作用浓度的增加,T24细胞Cyclin D1和CDK4的表达逐渐降低,而WAF-1/p21表达逐渐增强,呈显著的浓度依赖性。结论白藜芦醇能显著抑制T24细胞增殖,其抑制作用呈时间和剂量依赖性。白藜芦醇可以T24细胞明显阻滞于G1期,其分子机制可能是抑制T24细胞中Cyclin D1和CDK4的表达,并增强了WAF-1/p21蛋白的表达。第二部分白藜芦醇对人膀胱癌T24细胞凋亡的影响目的研究白藜芦醇在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞凋亡的诱导作用,并探讨其诱导凋亡的相关分子机制。方法采用流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测T24细胞凋亡的变化。采用Western blotting方法检测不同浓度白藜芦醇(0,50,100,150和200μM)作用24小时后,T24细胞中PI3K/Akt、ERK1/2和p38三条信号通路的改变,同时研究了Bcl-2家族、caspase-3和caspase-9等蛋白在白藜芦醇作用后表达的变化。结果1.不同浓度白藜芦醇(0,50,100,150和200μM)作用于T24细胞24小时后能明显诱导细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。2.光学显微镜显示不同浓度白藜芦醇(0,50,100,150和200μM)作用于T24细胞24小时后使细胞密度呈剂量依赖性降低,细胞形态改变也呈剂量依赖性,同时观察到凋亡细胞所具有的形态学改变。3.通过流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测发现白藜芦醇作用于T24细胞24小时后凋亡细胞数量呈剂量依赖性增加。白藜芦醇(0-200μM)作用24小时后产生的早期凋亡细胞为4.0%-14.1%;晚期凋亡细胞分别为2.6%-36.7%,总的凋亡细胞为6.6%-47.5%。4.白藜芦醇(0-200μM)作用24小时后,随着作用浓度的增加,T24细胞phospho-Ser473-Akt与phospho-ERK1/2的表达逐渐降低,但t-Akt与t-ERK1/2未见改变;phospho-p38表达逐渐增强,t-p38表达未见改变,三种信号蛋白表达变化均呈显著的浓度依赖性。5.白藜芦醇(0-200μM)作用24小时后,随着作用浓度的增加,T24细胞中Bcl-2与Bcl-xL的表达逐渐降低,而Bax表达逐渐增高,呈显著的浓度依赖性。6.白藜芦醇(0-200μM)作用24小时后,随着作用浓度的增加,T24细胞中Bax/Bcl-2的比例逐渐增高,呈显著的浓度依赖性。7.白藜芦醇(0-200μM)作用24小时后,T24细胞procaspase-3与procaspase-9表达降低,而caspase-3与PARP激活片段表达逐渐升高。结论白藜芦醇能诱导T24细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。白藜芦醇能显著抑制T24细胞PI3K/Akt信号通路的激活,调节MAPK通路的信号变化(ERK1/2与p38),进而引起Bcl-2家族蛋白变化,激活caspase-3,最终诱导凋亡发生。第三部分白藜芦醇对人膀胱癌T24细胞侵袭转移的影响目的研究白藜芦醇在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞侵袭转移能力的影响及其可能机制。方法MTT法检测白藜芦醇对T24细胞粘附纤维连接蛋白(fibronectin)能力的影响,Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭实验检测白藜芦醇对T24细胞侵袭能力的影响,划痕愈合试验检测白藜芦醇对T24细胞迁移能力的影响。采用Western blotting方法检测白藜芦醇(0,10,25,和50μM)作用24小时后的T24细胞中MMP-9蛋白的表达。结果1.白藜芦醇(0-200μM)作用90分钟后,随着作用浓度的增加,T24细胞粘附纤维连接蛋白能力逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。2.白藜芦醇(0-50μM)作用不同时间(0,8,16和24小时)后,T24细胞的迁移能力逐渐降低,呈显著的浓度和时间依赖性。3.体外的侵袭试验显示白藜芦醇(0-50μM)作用24小时后,随着作用浓度的增加,T24细胞侵袭能力逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。4.白藜芦醇(0-50μM)作用24小时后,随着作用浓度的增加,T24细胞的MMP-9蛋白表达逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。结论白藜芦醇能显著抑制T24细胞的粘附、迁移和侵袭能力。白藜芦醇这种侵袭转移抑制能力可能与降低MMP-9的表达有关。第四部分白藜芦醇抗肿瘤作用的体内实验研究目的研究白藜芦醇对裸鼠膀胱癌移植瘤生长的抑制作用及其可能机制。方法无菌条件下,裸鼠右后背侧部皮下接种膀胱癌T24细胞悬液,接种后,裸鼠在无菌、恒温和恒湿条件下饲养,待肿瘤直径长成约3mm大小时,采用随机数字法随机将24只Balb/C裸鼠分为3组,A组不予任何处理;B组腹腔内注射0.1ml丙二醇;C组腹腔内注射白藜芦醇(溶于0.1ml丙二醇,30 mg/kg)。每日给药1次,持续4周,每2日测量一次肿瘤体积。第28天处死裸鼠后取下标本,免疫组织化学法观察肿瘤组织CD34的变化,RT-PCR法检测肿瘤组织相关基因VEGF和FGF-2的表达情况。结果1.持续观察4周后,A组与B组移植瘤生长情况无明显区别,肿瘤体积变化无明显区别;实验前十天,C组移植瘤生长情况与另外两组无明显区别,从实验第十二天,C组肿瘤体积开始明显小于另外两组。2.通过免疫组织化学法观察肿瘤组织中CD34的变化,发现白藜芦醇处理组中,肿瘤标本CD34表达明显降低。3.RT-PCR法分析肿瘤组织基因后发现,白藜芦醇处理组中,VEGF和FGF-2的表达明显降低。结论白藜芦醇可以明显抑制裸鼠膀胱癌移植瘤的生长,这种作用可能与白藜芦醇降低肿瘤组织中CD34、VEGF和FGF-2的表达有关。