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母猪的繁殖性能会直接影响猪场的经济效益,是评判猪场生产能力的重要指标,从长远考虑,提高母猪的繁殖性能显得尤其重要。母猪的繁殖性能受到各种因素的调控,其中类固醇激素的合成与分泌会影响母猪的生殖生理过程,尤其影响卵泡的发育和排卵等关键过程。卵泡是卵巢中合成与分泌性腺类固醇激素的重要场所,颗粒细胞作为主要的卵泡细胞,在性腺类固醇激素的合成过程中发挥重要作用。促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)分别影响未成熟和成熟的颗粒细胞,会促进卵泡细胞的增殖、成熟以及性腺类固醇激素的合成,FSH与LH的合成与分泌有明显的生物节律性特点。生物节律是自然界中广泛存在的生命现象,具有能使机体适应环境和行为活动的周期性变化的功能。已有大量研究表明,卵巢中存在生物钟基因的表达,并且卵巢中的生物钟功能与类固醇激素合成、卵泡发育、卵泡体细胞分化和排卵过程等有关。其中,核受体NR1D1将昼夜节律和许多生理过程结合起来,已有研究报道NR1D1能够调节卵巢的昼夜节律和新陈代谢,但其对性腺类固醇激素合成的具体作用尚未阐明。因此,本研究旨在探讨NR1D1对类固醇激素合成和分泌的作用及其调控分子机制。在本研究中,通过分离培养猪卵巢颗粒细胞,使用NR1D1的激活剂、抑制剂与NR1D1 siRNA处理颗粒细胞,利用免疫组化、细胞免疫荧光染色、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附测定等一系列细胞、分子和生化检测方法,明确NR1D1对于类固醇激素合成和分泌的作用,并进一步探究其作用的分子机制。本研究主要获得以下结果:1.NR1D1广泛表达在猪卵巢颗粒细胞、卵泡内膜细胞、卵母细胞和基质细胞中,其中NR1D1在颗粒细胞中的表达量较高;细胞免疫荧光染色显示,NR1D1主要在颗粒细胞细胞核中表达;实时定量q PCR检测发现生物钟基因NR1D1和类固醇激素合成关键基因CYP19A1、CYP11A1、StAR在卵巢颗粒细胞中的表达呈现节律性变化。2.添加NR1D1激活剂GSK4112显著抑制了生物钟基因BMAL1和类固醇合成关键基因CCYP19A1、CYP11A1、StAR的表达;GSK4112处理后处于S期的细胞减少,说明激活NR1D1后抑制了颗粒细胞的增殖;ELISA的检测结果证明,生物钟基因NR1D1、BMAL1、CRY1,类固醇激素合成过程关键酶的基因CYP19A1、CYP11A1、StAR、3β-HSD和激素受体基因FSHR和LHCGR在对照组中的表达呈现明显的节律性,添加GSK4112能显著抑制猪卵巢颗粒细胞中雌二醇和孕酮的合成(P<0.05),减弱BMAL1、CRY1、CYP19A1、StAR、3β-HSD、FSHR和LHCGR的m RNA表达节律性,并且降低了基因表达振幅(P<0.05)。3.NR1D1 siRNA和抑制剂SR8278处理猪卵巢颗粒细胞后效果与GSK4112处理后相反,生物钟基因BMAL1、类固醇合成关键基因CYP19A1、CYP11A1、StAR、3β-HSD和激素受体基因FSHR、LHCGR、ERβm RNA的表达水平显著性升高,而且CYP19A1蛋白质表达量也显著上升(P<0.05);添加SR8278促进了颗粒细胞的增殖,显著抑制了猪卵巢颗粒细胞中雌二醇的合成;同时,生物钟基因BMAL1、CRY1、PER1、PER2,类固醇激素合成关键基因StAR和激素受体基因FSHR、LHCGR、ERβ在SR8278的作用下基因表达节律振幅显著提升,而CYP19A1的节律表达在SR8278处理后消失,并在12h之后表达量显著上升。4.为了探究CYP19A1是否在NR1D1调控雌激素合成过程中发挥作用,我们在添加NR1D1激活剂GSK4112或抑制剂SR8278的条件下分别对CYP19A1进行过表达和干扰,恢复试验证明过表达CYP19A1能消除NR1D1对雌激素合成的抑制作用,而干扰CYP19A1能促进NR1D1对雌激素合成的抑制作用;进一步通过双荧光素酶报告基因活性试验证明NR1D1通过与CYP19A1启动子区域-1228～-1223位点和-1116～-1111位点的RORE元件结合调控CYP19A1的转录,从而影响猪卵巢颗粒细胞中雌二醇的合成与分泌。综上所述,在猪卵巢颗粒细胞中,激活生物钟调控因子NR1D1后增强了NR1D1对转录活性的抑制作用,识别并结合CYP19A1启动子上的RORE元件,抑制CYP19A1的转录,导致雌二醇含量降低;而抑制了NR1D1与其配体结合的活性,从而消除了对CYP19A1的转录抑制能力,增加了猪卵巢颗粒细胞中雌二醇的合成与分泌。