研究背景:随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变,心血管疾病(CVD)已成为威胁人类健康的重大疾病,尽管近些年来,药物及血管再通术取得了极大的进步,但CVD的发病率和病死率仍然居高不下。其中,又以冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)对人类健康的威胁最大,冠心病及其并发症可导致严重的心血管事件,严重降低患者的生存时间和生活质量。传统的冠心病治疗手段(包括药物治疗、经皮冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术)虽可改善心肌供血、挽救濒死心肌细胞、延缓心脏重塑,显著改善冠心病患者的整体预后和生活质量,但却无法从根本上修复已经坏死的心肌细胞。对于发生急性大面积心肌梗死的患者而言,大量心肌细胞短时间内发生缺氧、坏死,逐渐被不具备收缩功能的纤维组织替代,从而形成疤痕并发生心脏重塑,并最终导致心力衰竭的发生。近年来兴起的干细胞治疗为心肌再生治疗提供了良好的细胞工具。已有多种自体/非自体干细胞被用于急性心肌梗死后的动物和临床前研究,其中一些取得了较好的疗效。诱导性多能干细胞(i PSCs)是通过将干细胞转录因子以逆转录病毒为载体导入成体细胞后制备而成的多能干细胞,具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的自我更新和多向分化潜能,理论上可分化成为来源于三个胚层的任意细胞种类。除具有与胚胎干细胞类似的特性外,i PSCs尚具有以下ESCs所不具备的诸多优势:1.无免疫原性;2.无伦理学争议;3.可制备成为疾病特异性的个体化细胞模型。近年来,i PSCs心肌定向分化率不断提高,使其在干细胞心肌再生治疗、疾病特异性细胞模型建立、药物心脏毒性监测等方面的应用取得了长足的发展。自噬是指细胞质内具有双侧膜结构的囊泡吞噬自身胞质内长寿蛋白质或细胞器,并与溶酶体结合后形成自噬溶酶体,随后降解其内容物的过程。自噬是细胞自身固有的一种防御机制,对维持细胞自稳态和保持细胞器的更新至关重要。有研究表明,自噬不仅与胚胎期心脏发育密切相关,同时也参与调控干细胞的体外心肌分化过程。但有关自噬对于人诱导性多能干细胞心肌定向分化的影响和具体机调控机制尚未见报道。研究目的:1.观察自噬对hi PSCs心肌细胞分化效率的影响。2.探索自噬调控hi PSCs心肌细胞分化的具体机制。研究方法:1.培养hi PSCs并进行干细胞标志物Oct4免疫荧光染色,验证其干细胞特性。2.使用悬浮法诱导hi PSCs形成拟胚体,优化自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)和自噬抑制剂氯化铵(NH4Cl)调控h EB自噬水平的条件。实验分组如下:(1)对照组;(2)雷帕霉素处理组(Rapa组);(3)雷帕霉素+10m M氯化铵组(R+N组),采用不同浓度的Rapamycin处理细胞,通过蛋白印迹实验观察细胞自噬水平变化,通过对自噬相关蛋白LC3免疫荧光染色、透射电镜计数自噬小体等方法检测各组间细胞自噬水平变化。3.采用优化后的自噬诱导条件,对hi PSCs心肌定向分化过程的不同阶段进行干预,通过拟胚体搏动区域计数、心肌细胞标志物c Tn T和MEF-2c表达水平筛选自噬调控hi PSCs心肌分化的最优条件;随后采用上述实验中得到的处理条件进行如下实验分组:(1)对照组;(2)雷帕霉素处理组(Rapa组);(3)雷帕霉素+氯化铵组(R+N组)。通过拟胚体搏动区域计数、心脏发育特异性标志物m RNA和蛋白水平检测等手段对自噬调控hi PSCs心肌细胞定向分化效率的过程进行观察;4.对上述实验分组细胞采用实时荧光定量PCR对不同自噬水平下细胞内经典Wnt通路的活性进行测定,检测各组间经典Wnt通路中的关键通路蛋白Dishevelled 2(Dvl 2)的表达水平;使用GSK-3β抑制剂CHIR-99021模拟激活经典Wnt通路活性,通过拟胚体搏动区域计数观察h EB心肌细胞分化效率;探讨自噬调控经典Wnt通路的具体机制。研究结果:1.hi PSCs在光镜下呈克隆生长,生长状态良好的克隆呈近圆形、边界清晰、克隆内细胞排列紧密、外观均一,与周边饲养层细胞分界清晰,干细胞标志物OCT4染色呈阳性;2.Westernblot检测结果表明,与对照组和其他浓度处理组相比,浓度为1μM的rapamycin处理拟胚体48h后,自噬蛋白LC3II/LC3I比值最大,自噬底物蛋白P62表达最低,即为诱导h EB自噬最佳条件;使用上述条件进一步实验发现:(1)与对照组相比,Rapa组和R+N组LC3荧光点数量均显著增加;(2)与对照组相比,Rapa组自噬体数量显著增加,R+N组自噬体数量显著减少;3.与对照组和其他时间处理组相比,在诱导分化第4-6天对h EB进行干预后,所得到的拟胚体所含搏动区域比例最高,同时心肌特异性标志物β-MHC、MEF-2c和c Tn T的m RNA表达量最高;进一步研究结果表明:(1)与对照组相比,Rapa组中搏动区域数量、心肌分化特异性标志物GATA4、Nkx2.5、Tbx5、c Tn T的m RNA表达含量均显著增高,相应基因表达水平在R+N组均显著降低;(2)与对照组相比,c Tn I阳性细胞率在Rapa组显著增高,而在R+N组显著降低;(3)心肌特异性蛋白MEF-2c和c Tn I表达量在Rapa组显著增高,在R+N组显著降低;4.与对照组相比,经典Wnt/β-catenin通路下游基因Axin2、c-Myc、Cyclin D1表达量在Rapa组显著下调,在R+N组显著上调,表明激活自噬可抑制Wnt通路的活性;进一步研究发现,Rapa组Dvl2蛋白表达显著下调,R+N组Dvl2蛋白表达则显著上调,表明自噬可能是通过调节Wnt通路蛋白Dvl2的含量来调控经典Wnt通路。加入GSK-3β抑制剂CHIR-99021上调wnt通路活性后,各组Wnt下游蛋白β-catenin表达含量均显著上调。此外,与未加药组相比,加药组拟胚体搏动区域数量显著下调,表明自噬可能是部分通过对Wnt/β-catenin通路的负性调控来发挥对hi PSCs的心肌分化效率的调节。研究结论:1.自噬可促进人诱导性多能干细胞向心肌定向分化的效率;2.自噬对hi PSCs心肌定向分化效率的促进部分是通过对经典wnt/β-catenin通路活性的负性调节而实现的。