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目的：各种研究表明,miRNA-499与人类各种疾病都具有一定的相关性,它与心血管疾病也具有十分密切的关系,尤其是在冠心病发展过程中,它能通过转录后调控的方式对其靶基因的翻译进行调控。冠心病血管内皮损伤时,miRNA-499的表达水平特异性增高,本研究经过一系列的中医四诊“望”、“闻”、“问”、“切”进行系统化的中医临床证候分型,即中医辨证分型,通过统计学的分析,对不同证型患者血样中miRNA-499的表达水平进行统计,分析不同证型患者miRNA-499表达水平是否存在差异,评估在冠心病不同中医证型中的含量水平。探讨miRNA-499在冠心病病理过程中的作用,为冠心病的中医辨证分型提供客观化指标。方法：1.病例选择：以2013年10月至2014年4月入住于广州中医药大学第一附属医院心血管内科住院病区患者为研究对象,纳入冠心病患者人数165例,均符合缺血性心脏病的诊断标准,男115例,女50例；平均年龄(55.5±19.8)岁；平均病程(6.5±2.1)年。均排除严重肝肾、造血系统疾病等原发性疾病、肿瘤、慢性感染、脑血管疾病、近期手术及创伤者、重度神经官能症者、精神异常者；排除中医辨证两型兼见无主次之分及证型复杂者。另设健康人对照组30例,均排除冠心病患者,男21例,女9例；平均年龄(56.5±10.5)岁。两组性别和年龄比较差异无统计学意义,具有可比性。2.冠心病组病人按照2012年《中药、天然药物治疗冠心病心绞痛临床研究技术指导原则》进行中医辨证分型；心血瘀阻型45例、男20例,女15例,平均年龄(54.5±11.8)岁,平均病程(5.5±2.1)年；气虚血瘀型40例,男25例,女15例；平均年龄(52.5±9.8)岁,平均病程(4.5±1.1)年；痰阻心脉型45例,男35例,女10例,平均年龄(49.5±9.8)岁,平均病程(6.5±1.1)年；心肾阴虚型35例,男25例,女10例,平均年龄(51.5±9.8)岁,平均病程(6.5±1.1)年。气滞血瘀型0例,阴寒凝滞型0例,气阴两虚型0例,阳气虚衰型0例,另设排除冠心病健康人志愿者30例。各证型间一般资料及可能影响miRNA-499浓度的因素(吸烟、高血压病及心衰等)经方差检验差异无统计学意义。3.总RNA的提取：取血液样本50ml,冷冻(4℃)高速(20000r/s)离心去上清,取沉淀物lml移入EP管中,加入1mL Trizol,颠倒混匀后室温下裂解5min后,低温离心；加入0.2mL氯仿溶液,混匀充分,室温静置5min；低温离心,上层透明液体转移入新EP管中,加入0.2mL异丙醇,静置1min后低温离心；弃上清加入1mL75%乙醇(DECP处理),轻振荡,离心弃上清；40μL DEPC处理无菌水溶解沉淀,最终获得总RNA样品溶液。Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定RNA样品浓度,-80℃保存样本。4.RNA逆转录实验：(总反应体系5OμL) RNA template (500-550ng/μL)1μL, miR-499RT Primer (62.5nM)4μL, RNase-free H2014μL,70℃10min,0℃2min;5XPrimeScript Buffer10μL, Prime Script RT Enzyme Mix2.5μL, Random6mers(100μM)10μL, template19μL, RNase-free H2O8.5μL,37℃×3,85℃5sec。5.qRT-PCR实验：(总反应体系20.0μL) SYBR Green Mix9μL, miR-499Forward Primer2μL, MiR-449a Reverse Primer2μL, Template cDNA2μL, RNase-free H2O5μL；反应条件为95℃20s预变性；95℃10s、60℃20s、70℃10s采集荧光,共40cycles,溶解曲线分析：70℃-95℃,升温速率0.4℃/次,恒温时间lsec/次。同时进行内参U6的荧光定量检测。6.统计学方法：采用SPSS13.0软件进行统计学分析,用均数±标准差(x±S)表示miRNA-499表达水平,显著性水准取0.05,采用双侧检验,p<0.05为差异有统计学意义。成果：各组miRNA-499表达水平的差异有统计学意义,心血瘀阻型、痰浊心脉型、气虚血瘀型、心肾阴虚型miRNA-499表达水平较空白对照组上调(P<0.05),心血瘀阻型miRNA-499含量较痰浊心脉型、气虚血瘀型、心肾阴虚型上调(P<0.05)。结论：大量文献表明,心脉的病变是引起心络绌急而致心痛猝然发作的重要因素。心络瘀阻和绌急日久可导致真心痛即急性心肌梗死的发生。miRNA-499水平与冠心病的病变程度有一定的关系,可作为中医辨证分型的参考指标。