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背景：肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的必经过程。肝星状细胞扮演了这一过程的核心角色。近30年来,中医药在肝纤维化防控领域发挥了重要作用。众多中药及复方曾在肝星状细胞特定基因表达、胞内信号通路、细胞增殖及凋亡等领域进行过研究。目前认为中医药抗纤维化具有多靶点,多层次的特点,但常规研究很难反映这一特点。全基因组基因芯片及高通量测序技术是基因研究的最新技术,可以对特定时间的mRNA及miRNA基因表达谱进行全面反映,生物信息学的发展则提供了对大量数据进行系统分析的工具。上述技术的出现为中医药研究提供了有力的工具和空前的发展机遇。扶正化瘀方(胶囊)是临床常用、疗效稳定的抗肝纤维化药物。该复方也是目前研究最系统的抗肝纤维化中成药之一。利用全基因组芯片及高通量测序技术对该药进行研究有助于揭示中医药抗纤维化的重要机制。目的：本研究拟探索扶正化瘀含药血清对HSC-T6细胞mRNA及miRNA表达谱的干预特征,阐明该药物在基因层面抗纤维化的作用机制。方法：1参照血清药理学原则,按照文献报道方法为大鼠灌服扶正化瘀溶液及对照溶液,采集大鼠血清制备扶正化瘀含药血清及对照血清。对大鼠HSC-T6细胞系进行体外培养24小时,然后同步使用扶正化瘀大鼠含药/对照血清进行干预24小时,提取细胞总RNA,并使用realtime PCR技术,对Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1的mRNA表达水平进行检测,通过上述效应基因的实际表达水平验证实验系统的稳定性。2使用Affymetrix公司Rat 2302.0对提取的总RNA进行mRNA表达谱的基因芯片检测,获取mRNA的基因芯片表达谱。利用DAVID网站整合数据库对2倍法筛选的差异基因进行基因本体学(GO)、KEGG信号通路(KEGG pathway)分析,对差异基因的功能富集情况和信号通路富集情况进行描述。3以上述总RNA为材料,使用Solexa miRNA高通量测序法建立miRNA文库,获取miRNA的表达谱。利用targetscan网站提供的预测数据库,对2倍法筛选的miRNA差异基因进行靶基因预测。对预测获得的靶基因利用DAVID网站进行G0及KEGG信号通路分析,对预测靶基因的功能富集情况和信号通路富集情况进行描述。将分析结果与mRNA表达谱的分析结果进行比对,筛选验证研究方向。4对筛选出的MAPK信号通路,通过western-blot方法,对其核心蛋白(ERK, JNK,p38)及其磷酸化形式进行研究,明确药物对该通路的调控特点。5结合mRNA表达谱和miRNA巴基因谱的GO分析结果,MAPK通路调控特点、细胞培养中发现的细胞凋亡现象,进一步确定了细胞凋亡为验证方向。使用annexin V/7aad双染色,流式细胞仪分析平台,对HSC-T6细胞凋亡情况进行研究。结果：1 mRNA表达谱检测中,差异基因共有637条,其中334条为已知基因。GO分析发现,这些基因在细胞发育、结构发育、细胞过程调节、细胞粘附、细胞组分机化调控方面具有重要作用。KEGG信号通路分析发现具有显著性差异的为RIG-I-like受体信号通路和MAPK信号通路,其中MAPK信号通路与肝纤维化密切相关,其中Prkcg、TNF、Faslg、Rasa2、Gna12、Mapk8、Illr2、Fgf23、Fgf12、Map3k3、Rasgrp2等11条基因对ERK、JNK、p38三条通路有重要调控作用。2 miRNA表达谱中共有差异基因75个,通过targetscan网站获得预测靶基因1962个,通过DAVID网站分析发现,预测靶基因在发育过程,生物调节,细胞过程,细胞组分机化,生长,生物粘附等方面有富集；KEGG通路分析提示,基因富集具有显著性差异的通路总计29条,去除与肿瘤相关的通路后共剩余16条通路。其中大部分在肝纤维化领域均有研究,而MAPK通路富集最为显著。通过与mRNA表达谱研究结果的比对,确定了MAPK通路为进一步验证方向。3通过realtime PCR技术,我们发现4项指标的mRNA表达水平均有下降。其中Ⅰ型胶原mRNA表达下降27%,Ⅲ型胶原mRNA表达下降36%,α-SMA mRNA表达下降43%,TGF-β1 mRNA表达下降23%。研究结果提示在扶正化瘀大鼠血清的干预下,维持HSC-T6细胞持续活化的TGF-β1表达下降,HSC-T6细胞的活化标志物表达受到抑制,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达发生下调。4通过对MAPK下三条通路核心蛋白及其磷酸化形式的研究发现扶正化瘀大鼠血清确实对该通路发生了重要的调控：ERK通路上调(P<0.05),JNK通路下调,p38通路上调(P<0.05)。结合HSC-T6细胞本身为活化细胞的背景,我们预测该通路的变化可能会促进细胞凋亡。5通过对HSC-T6细胞的annexinV、7aad双染色流式细胞仪研究发现,扶正化瘀大鼠含药血清与对照组血清比较,具有明显促进细胞凋亡的生物学效应,无论早期凋亡(P<0.05)、晚期凋亡(P<0.05)、总凋亡(P<0.05),均具有显著性差异。结论：1通过上述系列研究,我们证实扶正化瘀大鼠血清对HSC-T6细胞的mRNA及miRNA表达谱产生了广泛的调控作用。2对两个表达谱的GO分析提示,差异基因在细胞粘附、发育、凋亡等方面存在富集；3 KEGG通路分析提示,MAPK通路是重要调控通路。4研究结果提示niRNA的负性调控作用在其中发挥了重要作用。5扶正化瘀含药血清可促进HSC-T6细胞凋亡。6 MAPK通路关键蛋白表达水平提示：该药可上调p38通路,下调JNK通路,这可能是扶正化瘀大鼠血清促进HSC-T6的凋亡的主要机制。7对肝纤维化关键基因的RealtimePCR检测提示：该药可通过抑制TGF-β1表达,降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生,抑制细胞本身的持续活化。