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低氧是一种特殊的环境应激,它不仅反应细胞和机体组织的供氧不足,也出现在各种生理和病理环境中,包括胚胎发育、组织缺血和肿瘤微环境。另一方面,水体环境低氧对鱼类而言是限制生长发育和存活的重要影响因素。为了应对低氧应激,需氧的机体和细胞进化出一些复杂而高度协调的应答机制,其中进化上高度保守的HIF介导的通路是细胞低氧应答的核心信号传导途径。MicroRNAs（miRNAs）作为一类重要的转录后基因表达调控因子,同样在低氧介导的细胞应答中发挥重要功能。同时,血液循环是生物体氧气运输的主要途径,正常的胚胎造血过程和血液系统恶性肿瘤同样受到miRNAs的调控。本研究以脊椎模式生物斑马鱼为对象,通过二代测序技术鉴定低氧应答相关miRNAs。随后,通过细胞和胚胎水平的过表达或敲降实验,结合mRNA表达谱测序对硬骨鱼类特有的miR-462-731簇的功能进行深入研究,阐明它在细胞低氧应答及胚胎血液发生中的功能和作用机理,为脊椎动物低氧应答调控机制研究提供了新的思路和方向。本文主要研究结果如下:1.通过miRNA表达谱分析,从斑马鱼胚胎中鉴定出10个潜在受低氧调控的miRNAs（hypoxia-regulated miRNAs,HRMs）,其中 miR-181a和miR-150 为哺乳动物细胞中广泛认知的HRMs,另外一些在低氧应答中的功能尚未研究,包括硬骨鱼类特有的miR-462-731簇。靶基因预测和功能分析表明,这些潜在HRMs参与调控一些重要的生物学过程,包括细胞生长、糖酵解和DNA修复等。2.启动子活性分析发现,低氧条件下Hif-1α能通过靶向结合miR-462-731上游低氧应答元件（hypoxia response element,HRE）直接调控其转录,并且在胚胎和细胞水平影响内源miR-462-731表达。基于荧光素酶活性分析及Western blot检测,证实DEAD box RNA解旋酶家族基因ddx5（DEAD box helicase 5）和蛋白磷酸酶基因ppm1da（protein phosphatase,Mg2+/Mn2+ dependent,1 Da）分别为 miR-462和miR-731直接下游靶基因,并且miR-462和miR-731能通过靶向抑制其表达,诱导细胞周期停滞和抑制细胞增殖。最终将miR-462-731定位于经典HIF-1低氧信号传导途径的下游,通过靶向调控ddx5和ppm1da参与细胞低氧应答。3.整胚原位杂交和半定量PCR分析发现,miR-462和miR-731在斑马鱼早期胚胎发育中呈现一致的广泛高表达模式,受精后48 h开始富集于脑、眼、体节肌和鳍等部位,受精后3至5d特异存在于肝脏和消化道区域;在成鱼中其表达没有明显组织特异性,但在鳔、眼、肠、鳍和鳃中表达相对较高。miR-462/miR-731 MO敲降导致斑马鱼早期胚胎发育缺陷,并且mRNA表达谱分析显示相关基因表达异常。另外,MO敲降体的脑、眼、尾和心包腔检测到明显的凋亡信号。推测miR-462-731一定程度上通过影响细胞存活调节正常早期胚胎发育和器官形成。4.miR-462/miR-731敲降导致斑马鱼胚胎红细胞缺失及血流障碍,但髓细胞异常增多,并伴随一系列造血相关基因表达异常。整胚原位杂交证实miR-462/miR-731敲降导致血液血管母细胞标记基因etsrp和scl在头部侧板中胚层（anterior lateral plate mesoderm,ALPM）异常增多,并引起pu.1标记的髓系祖细胞增加。结果表明miR-462-731能作用于etsrp上游,在pu.1决定髓系分化命运之前,通过调控etsrp/scl信号通路影响ALPM原始髓系细胞生成。另一方面,启动子活性分析证实Pu.1可以通过靶向结合miR-462-731簇启动子区域的一个硬骨鱼类中高度保守的应答元件,转录激活其内源表达。并且miR-731能反过来靶向抑制pu.1的表达。该结果证实了一个未报道的pu.1/miR-462-731反馈调控机制,该机制可以干扰pu.1和gata1之间的互相作用,进而影响早期造血红-髓系分化。5.将miR-462和miR-731的预测靶基因和MO敲降体中差异表达基因的KEGG pathway富集结果进行整合分析,发现miR-462和miR-731可能通过靶向调控不同的下游靶基因而协调调控重要信号通路,包括TGF-β信号通路。研究发现miR-462/miR-731敲降引起以尾部中间细胞群（intermediate cell mass,ICM）异常膨大和血细胞堆积为特点的弱腹侧化表型。分子水平检测发现70%-外包期磷酸化Smad1/5和alk8表达上调。表明miR-462/miR-731敲降引起Alk8介导的BMP/Smad信号通路异常激活,导致早期中胚层祖细胞造血特化的增强。挽救实验证实miR-462-731在Bmp2b/7信号通路中作用于alk8上游,并发挥了内源BMP拮抗物的功能。6.此外,miR-462-731能影响肌间血管形成,调节动-静脉分化。另外miR-462和miR-731预测靶基因显著富集于Notch信号通路,因此推测,miR-462-731可能参与Notch介导的血管发育调控,继而影响血液循环和永久造血中造血干细胞（HSC）生成。但还需要更深入的研究揭示miR-462-731在Ntoch信号通路中的具体调节功能。