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凝乳酶（chymosin,EC 3.4.23.4）是一种天冬氨酸蛋白酶,是干酪加工过程的关键性酶。凝乳酶传统上是从未断奶的小牛皱胃中提取,随着干酪产量增加,这种方法已不能满足当前市场的需求。基因工程菌株作为一种新的高效蛋白生产途径,有望解决牛凝乳酶来源短缺的难题。本研究将牛来源凝乳酶原基因在巴斯德赤酵母系统中异源表达。通过密码子优化、融合标签蛋白表达、启动子选择和发酵条件优化的策略提高重组牛凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量。依据毕赤酵母的密码子偏好性,按照OptimumGeneTM算法对牛凝乳酶原基因pcw进行密码子优化得到pcm14基因。在pcm14基因前端融合标签蛋白基因cherrym得到clpcm14基因。pcm14和clpcm14基因在毕赤酵母中表达,分别筛选到产酶活力最高的菌株2-70和clp2-91。在摇瓶水平这两株菌中目的基因转录水平相近,基因拷贝数相同,凝乳酶活力分别为2188 SU/mL和3705SU/mL。在clpcm14基因表达盒的基础上,用组成型启动子PGAP替换甲醇诱导启动子PAOX1,筛选得到高表达菌株GH-1。对GH-1菌株的发酵过程进行工艺优化,包括pH值、补料方式和碳源的优化。发酵最优条件是pH 4.0,以葡萄糖为碳源,采取分批补料方式发酵。GH-1菌株生产凝乳酶活力最高可达到12000 SU/mL,培养基中蛋白含量为0.28 mg/mL。在3 L发酵罐水平,组成型菌株GH-1的生产强度是诱导型菌株clp2-91的3倍。本研究将多种可提高毕赤酵母菌株外源蛋白表达量的优化策略进行组合,筛选到的高产菌株GH-1能够高效生产牛凝乳酶原,其生产强度满足酶制剂生产企业需求,有很高的工业化大规模生产潜力。