急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是指由心源性以外的各种肺内、外致病因素所导致的急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭。其发病机理错综复杂,迄今尚未完全阐明,亦无满意的治疗措施,病死率高达50%。根据其临床表现,ALI当属中医学“肺热证”、“喘证”、“结胸”等范畴。近年来,中医药工作者结合现代医学对ALI发病机制的研究新进展,采用辨病与辨证相结合,从热毒论治ALI,虽取得了一定疗效,但并未显著降低其死亡率;因此,深入研究ALI的中医发病机制并在其指导下寻找有效方药,是其治疗研究中的新途径和优势所在。有资料表明,引发ALI的致病菌中,G-占检出病菌的70%~80%,内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是G-的主要抗原性及致病性成分,而Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)是LPS的跨膜信号转导受体,因此,TLR4介导的LPS信号转导通路在ALI发生发展过程中的应起重要作用。这一理论亦体现了从治“人的病”到治“病的人”的治疗策略的转变,提示我们应重视中医肺生理病理与ALI发病之间的关系。基于以上认识,本课题提出肺失宣降、邪毒壅肺、气机逆乱是ALI的中医发病机制,而宣肺解毒法顺应肺之生理、契合病机是ALI早期阶段的基本治疗原则,以此为指导思想的加味桔梗汤亦有望是治疗ALI的有效方药。目的1.探讨TLR4介导的LPS信号转导通路在ALI发生发展中的作用;2.阐释中医肺生理病理与ALI发病之间的关系,揭示肺藏象理论及ALI相关病机的现代生物学基础;3.探讨“宣肺解毒”治疗早期ALI的可行性及科学性;4.从整体、细胞、分子水平阐明加味桔梗汤治疗LPS致ALI的作用机制,为临床防治ALI提供实验依据。方法1理论研究基于中医肺藏象理论与ALI发病之间的关系及仲景宣肺法证治概要,从理论上探讨“宣肺解毒”治疗早期ALI的科学性和可行性,并进一步阐释加味桔梗汤治疗ALI的理论依据。2实验研究2.1加味桔梗汤治疗LPS致急性肺损伤大鼠的药效学研究健康雄性SD大鼠90只,随机分为正常组(9只)、模型组(27只)、清热解毒组(27只)、宣肺解毒组(27只)。清热解毒组灌服黄芩清肺饮(由黄芩、栀子等组成),宣肺解毒组灌服加味桔梗汤(由桔梗、生甘草、黄芩、栀子等组成),其余两组灌服生理盐水,共6天。第7天,除正常组外,其余各组一次性股静脉注射LPS(4.9mg/kg),正常组一次性股静脉注射等量的生理盐水,观察并记录各组大鼠症状体征改变。除正常组外,其余三组动物于造模后2h、4h和6h随机分三批处死,其中3只麻醉后,用4%多聚甲醛经右心室灌洗后固定,制成光镜标本;6只麻醉后,快速开胸取肺,称重后投入液氮速冻。通过检测肺系数、肺含水量、肺组织匀浆髓过氧化物酶含量等来评价黄芩清肺饮及加味桔梗汤对LPS致急性肺损伤大鼠的治疗作用。2.2加味桔梗汤治疗LPS致急性肺损伤的机制研究分组及造模方法等均同药效学实验。用生化法测定肺组织匀浆SOD、MDA及血清NO、NOS、iNOS的含量;用双抗体夹心-酶联免疫吸附(ABC-ELISA)法检测血清TNF-、IL-1β、IL-6、及IL-10的含量;用Western-blot及免疫组织化学法测定肺组织NF-κB的蛋白表达;用RT-PCR法测定肺组织TLR4 mRNA的表达。结果1理论研究ALI的发生发展与中医肺之生理病理密切相关:ALI病位在肺;邪毒袭肺、肺失宣降是ALI发生的病理基础;正邪交争、内生之毒续生,毒邪壅肺、气机逆乱是ALI加重的病理环节;治节失司、肺不主气是ALI转危之关键;宣肺解毒是ALI早期阶段的重要治疗原则;以宣肺解毒法为指导思想的加味桔梗汤顺应肺藏生理、契合病机,可有效改善ALI时肺脏功能失调。2实验研究通过以上实验得到以下结果:1.中性粒细胞于肺内“扣押”是LPS致急性肺损伤的启动及进行阶段中的早发事件,其引起的肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞广泛损伤是导致肺通透性增加,肺水肿及微血栓形成的关键所在;2.LPS致急性肺损伤发生发展过程中存在氧化/抗氧化平衡紊乱;3.LPS致急性肺损伤发生发展过程中存在致炎反应/抗炎反应平衡紊乱:TNF-、IL-1β大量、快速表达是单核巨噬细胞活化的分子标志;IL-10在ALI早期的高表达预示着机体的免疫功能紊乱;4.LPS致急性肺损伤时,存在NF-κB由细胞浆向细胞核的转移,其激活在LPS致急性肺损伤发病中起核心作用;5.Toll样受体不仅是抵抗外邪侵袭的第一道防线,而且是机体先天免疫与继发免疫之间的桥梁。ALI时,肺组织TLR4 mRNA的大量表达是加重ALI的病理过程中急性炎症反应网络的重要扳机点之一;6.以宣肺解毒为指导思想的加味桔梗汤治疗LPS致急性肺损伤的机制主要为:(1)减少中性粒细胞在肺内的黏附和聚集,从而减少其对肺组织的浸润;(2)促进机体产生抗氧化因子,提高机体对氧自由基的清除能力,调节氧化/抗氧化平衡;(3)显著降低LPS致急性肺损伤大鼠血清中致炎因子TNF-、IL-1β及抗炎因子IL-10的含量;(4)抑制LPS致急性肺损伤肺组织NF-κB p65由胞浆向胞核转移,阻断众多炎性因子的表达;(5)抑制LPS致急性肺损伤大鼠肺组织TLR4 mRNA基因表达,调控NF-κB等转录因子的激活。结论综合理论及实验研究结果,得出以下结论:1宣肺解毒治疗早期ALI的可行性及科学性基于中医肺藏象理论与ALI发病之间的关系,认为ALI病位在肺,病机关键是邪毒犯肺、肺失宣降;而全身气血津液运行输布障碍,热、瘀、毒、水(或痰、湿、饮)等病理产物骤生,壅阻肺络、气机逆乱是其发展加重的核心环节;正虚邪盛、治节失司、肺不主气是ALI转危之关键。这一中医学发病机制提示肺生理功能在ALI发生发展中起重要作用,并启发了治疗ALI早期阶段的根本原则──宣肺解毒。总之,从理论上讲,早期宣肺解毒的治疗原则不但突破了过于强调热毒致病的传统理论,而且是仲景治疗肺系疾病时重在宣肺祛邪这一指导思想的继承和发扬。2中医学肺藏象理论与ALI相关病理环节的现代生物学基础ALI发病过程中伴氧自由基大量生成、炎症因子的过度表达、细胞凋亡等多种病理反应,其复杂性表明,LPS致急性肺损伤存在多种病理环节,临床应采用综合疗法,多靶点治疗原则。因此,深入系统研究TLR4介导的内毒素信号转导途径不但为临床控制急性肺损伤时瀑链式炎症反应提供切入点,而且部分揭示了中医学肺卫相关、毒邪致病及肺主治节等宏观理论与Toll样受体通路这一微观层次的病理机制之间的生物学基础,构建了ALI发病宏观病机与微观病机之间的桥梁。3加味桔梗汤治疗LPS致急性肺损伤的药理学机制肺失宣降、邪毒壅肺、气机逆乱是ALI的核心病理环节,而邪毒是导致ALI损伤的重要因素。因此,在ALI早期,应宣肺解毒、截断病程;宣肺以解毒,解毒以宣肺,恢复肺脏生理功能。另外,复方中药配伍的协同作用可体现在不同病理环节、不同靶点生物学效应等方面,加味桔梗汤能显著改善LPS所致的肺水肿,能调控致炎反应/抗炎反应、氧化/抗氧化平衡及肺组织TLR4 mRNA基因表达等,对这些病理生理环节的干预作用可能是加味桔梗汤治疗ALI的药理学机制。