离子强度对酶活性的影响研究

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本论文研究隶属于科技部十三五国家重点研发计划项目(2018YFD0400300)。离子强度的静电相互作用对细胞内外的生物大分子功能都有着非常广泛的影响。生物大分子中的酶对人体的营养调节以及食品加工(腌制、乳制品)具有重要作用。然而,离子强度对于酶所处微环境的静电相互作用有很大影响,进而会影响酶作用的发挥。本文应用体外模型以枯草芽孢杆菌蛋白酶、猪胰α-淀粉酶、β-半乳糖苷酶为研究对象,研究离子强度对其活性的影响以机理,同时体内实验通过改变HEK293细胞培养基中离子强度,观察细胞内离子强度随时间改变,并进一步研究细胞内离子强度改变HEK293细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。本文主要研究内容以及结果如下:(1)离子强度(NaCl)对枯草芽孢杆菌属蛋白酶活性影响的研究,发现离子强度(NaCl)对蛋白酶有抑制作用,随着离子强度增加,对酶的抑制作用越强,且酶促动力学参数Km和Vmax都减小。进一步通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、圆二色谱以及分子模拟等方法探究其原理。结果表明,蛋白酶与作用环境中的离子产生静电相互作用,使其表面粗糙,官能团-C=O和-C-N以及严重地破坏蛋白酶β-折叠的氢键,改变平行和反平行结构的比例,反平行的比例越大,平行越少,进而导致蛋白酶活性降低。(2)离子强度(NaCl)对猪胰α-淀粉酶活性影响的研究,发现离子强度的增加,对淀粉酶的抑制作用随之增强,且其酶促动力学参数Km和Vmax同时也减小。进一步通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、圆二色谱以及分子模拟等方法探究其原理,结果表明,α-淀粉酶与作用环境中的离子产生静电相互作用,使其表面粗糙,官能团-C=O和-COO-以及二级结构中螺旋结构先增加后减少,且折叠先减少后增加,并且影响着酶活中心催化集团,进而导致α-淀粉酶活性降低。(3)离子强度(ZnSO4)对β-半乳糖苷酶活性影响的研究,发现微环境中离子强度增加对β-半乳糖苷酶有抑制作用增强,且酶促动力学参数Km和Vmax都减小。进一步通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、圆二色谱以及分子模拟等方法探究其原理,结果表明,β-半乳糖苷酶与微环境中的Zn2+产生静电作用,是官能团-CH2和-COO-发生改变,同时酶催化中心也受Zn2+影响,进而导致β-半乳糖苷酶活性降低。(4)通过使用含有200 mM NaCl的培养基培养HEK293细胞,发现随培养时间的增加细胞内离子强度不断增加,30min内下降趋势较大,30min后逐渐趋于稳定。在显微镜下观察经过200 mM NaCl培养基培养的细胞形态,发现部分细胞出现轮廓不清晰状态,并且SOD酶活性30min内处于稳定状态,而30min后SOD酶活性受到抑制作用。综上所述,体外和体内实验都证明酶所在微环境的离子强度的改变,能够改变酶与离子间的静电相互作用以及结合作用,而使酶的表面、官能团以及二级结构发生变化,从而影响酶活性的发挥。探究离子强度对体外酶活性的影响及机理,为探究体内酶活性改变机理打下基础,并且对食品加工以及营养调节(如血糖、消化吸收以及乳糖不耐等)功能性食品的作用发挥有重要意义。
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