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胃癌是我国常见的恶性肿瘤,占消化道恶性肿瘤第一位,是目前对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,已成为绝大多数国家因癌症死亡的首要原因。目前对胃癌的治疗还是传统的手术、化疗和放疗。尽管传统治疗方法取得了显著进展,但胃癌的病死率仍然居高不下,同时化疗和放疗也往往给患者带来较大的毒副作用。近年来,国内外学者对中医药防治胃癌开展了大量的研究工作,其在防治胃癌发病及提高患者生存率方面的独特疗效,受到国内外学者的广泛关注。诱导细胞凋亡已成为中医药防治胃癌的重要机理之一。泽泻醇B-23-乙酸酯是三萜类纯中药提取物,为泽泻科植物泽泻[Alismaorientalis(Sam) Juzep]的主要成分,具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝、抗炎、抗过敏等作用。近年的研究表明其可通过激活caspase-3诱导肝癌细胞凋亡;使肿瘤细胞阻滞在G2/M期诱导淋巴瘤细胞凋亡;逆转P-gp导致HepG2-DR和K562-DR细胞的耐药性,诱导HepG2-DR和K562-DR细胞凋亡。进一步研究显示其可通过线粒体内源性途径诱导耐激素性前列腺癌PC-3细胞的凋亡,同时前列腺癌细胞促凋亡因子bax蛋白表达增加,并发生细胞质向细胞核的转移。对肺癌的研究提示泽泻醇B具有较强的抗恶性肿瘤转移作用。本实验研究了泽泻醇B对SGC7901细胞增殖、细胞周期及调亡的影响,检测细胞凋亡过程中线粒体膜电位及caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2及PI3 K/Akt信号转导通路的变化;研究泽泻醇B对胃癌细胞侵袭及迁移的影响,及在抑制胃癌细胞侵袭、迁移过程中,MMP-2、MMP-9活性、蛋白及PI3 K/Akt信号转导通路的变化,阐明泽泻醇B诱导胃癌细胞凋亡,抑制其侵袭及转移的机制,为其进一步临床应用提供理论依据。方法一、实验材料1、人胃腺癌细胞系SGC79012、泽泻纯B3、流式细胞仪检测相关染料4、Western印迹杂交相关试剂5、细胞侵袭实验相关材料二、实验方法1、MTT检测泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞体外增殖的抑制作用2、PI染色流式细胞仪(FCM)分析细胞周期3、Annexin V-FITC染色检测细胞早期调亡4、倒置显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化5、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片断化6、罗丹明-123染色、流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化7、Transwell小室分析泽泻纯B对胃癌SGC7901侵袭、迁移的影响8、酶谱分析法检测MMP-2、MMP-9活性的变化9、Western-blot半定量法检测Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2、PI3 K/Akt、MMP-2、MMP-9表达情况结果1、MTT法检测结果显示30μmol/L以上浓度泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞体外增殖的具有明显的抑制作用,该抑制作用呈明显的时间和剂量依赖性(P＜0.05或P＜0.01)。2、显微镜下细胞稀疏、变圆、皱缩,一些细胞膜向外鼓出小泡,然后脱落形成凋亡小体;透射电镜,细胞核内异染色质凝聚;细胞核膜溶解,核内异染色质凝聚破碎成多块于胞质中,并见有膜包裹,形成凋亡小体。3、琼脂糖凝胶电泳见明显的梯形条带,具有时间依赖性(DNA ladder)。4、Annexin V-FITC/PI荧光染色,流式细胞分析Annexin V/FITC(+),PI(-)细胞即早期凋亡细胞增加(P＜0.05)。5、PI染色染色流式细胞仪检测细胞周期,S期细胞的比例逐渐降低,G1期细胞的比例逐渐升高,并存在时间依赖性。同时在流式细胞仪DNA组方图上出现典型的凋亡细胞峰(亚G1峰)。6、罗丹明-123染色流式细胞仪检测线粒体膜电位,泽泻纯处理12小时后SGC7901线粒体膜电位开始下降,随着作用时间的延长下降比例逐渐增加具有时间依赖性。7、Western-blot半定量法检测Bax表达增高,持续维持在高水平;Bcl-2表达降低,持续维持在低水平8、Western-blot半定量法检测caspase-3和caspase-9,caspase-3出现17 ku的断裂片段,47 kucaspase-9出现37ku的断裂片断,且二者的活性片断随着泽泻纯作用时间的延长持续维持在高水平;9、Western-blot半定量法检测磷酸化的PI3 K、Akt(Thr308)表达量降低,而总的PI3 K、Akt的量没有变化。10、细胞侵袭迁移能力的检测。应用Transwell小室检测泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞侵袭、迁移能力的影响,发现泽泻纯B处理后实验组细胞的侵袭、迁移能力有明显降低,迁移及侵袭过Transwell小室膜的细胞随药物浓度的增加逐渐减少,并具有剂量依赖性11、酶谱分析法检测泽泻纯B处理前后SGC7901细胞MMP-2、MMP-9酶活性,Western-blot半定量法检测MMP-2,MMP-9蛋白表达量情况,随着药物作用时间的延长MMP-2、MMP-9酶活性逐渐降低,MMP-2,MMP-9蛋白表达量逐渐下降,并具有时间依赖性结论1、泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞体外增殖具有明显的抑制作用,该抑制作用呈明显的时间和剂量依赖性2、显微镜下、透射电镜DNA片断化分析及Annexin V-FITC/PI荧光染色流式细胞分析证实了泽泻纯B诱导SGC7901细胞的凋亡。3、泽泻纯B诱导SGC7901细胞凋亡的信号转导途径中多种基因、蛋白酶以及多种激酶参与了凋亡的调控。Bcl-2、Bax表达的改变,线粒体膜电位的下降,进而caspase-9、caspase-3的激活,PI3K/Akt激酶的激活参与细胞凋亡的调控。4、泽泻纯B导致SGC7901细胞周期的改变,使SGC7901细胞阻抑在G0/G1期,细胞周期的改变参与了细胞凋亡的发生5、泽泻纯B抑制SGC7901细胞侵袭和转移,MMP-2、MMP-9活性的下降,蛋白表达的降低在泽泻纯B抑制SGC7901细胞侵袭和转移在过程中起重要的调节作用。