褪黑素在番茄镉胁迫抗性中的功能研究

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土壤环境受重金属污染问题日益受到人们的关注,重金属危害蔬菜作物安全生产成为了一个亟待解决的严峻问题。通过对蔬菜作物应对重金属污染机制与解毒途径的研究有助于该问题的解决。褪黑素是一种天然的吲哚胺类小分子化合物,能够在大部分的植物中合成,在植物抗逆中起到重要的作用。本文以重要的蔬菜作物番茄(Solanum lycopersicum L.)为研究材料,构建了植物螯合肽合成基因PCs沉默的TRV-PCs植株,褪黑素合成基因COMT沉默的TRV-COMT植株及双基因共沉默的TRV-COMT-PCs植株,研究了COMT基因和PCs基因在番茄镉胁迫抗性中的功能;之后,利用前述材料,进一步探究了褪黑素对镉胁迫下番茄的生理生化的影响;最后,利用序列比对及烟草双荧光素酶实验研究了Cd胁迫下miR169b靶定TDC基因,并调控植株内源褪黑素合成的机制。所取得的主要研究结果如下:1.研究COMT基因和PCs基因在番茄镉胁迫抗性中的功能及褪黑素在缓解番茄镉胁迫中的作用。实验使用TRV,TRV-PCs,TRV-COMT和TRV-COMT-PCs番茄植株作为材料。COMT基因通过调控番茄植株内源褪黑素的合成,缓解Cd胁迫对番茄植株生长发育造成的损伤,维持叶绿素合成,及通过清除ROS和MDA来维持细胞稳定,减轻细胞膜脂质过氧化程度,减少自由基对植物细胞的破坏,同时恢复光化学效率,从而增强番茄Cd胁迫抗性;而PCs基因通过调控番茄植物螯合肽的合成,同样能一定程度地缓解番茄在Cd胁迫下的生长抑制,生物量减小和叶绿素合成受阻的不利影响,并通过螯合Cd等方式解毒,从而增强番茄Cd胁迫抗性。此外,预处理外源褪黑素能够部分恢复COMT沉默植株的Cd抗性,同时也能够提高PCs沉默植株的Cd抗性,验证了褪黑素在缓解番茄Cd胁迫中的积极作用。2.研究褪黑素在番茄Cd胁迫中对番茄植株生理生化的影响。褪黑素通过影响GSH/GSSG和AsA/DHA调节番茄植株体内的氧化还原平衡,增强了番茄植株体内抗氧化能力和维持体内氧化还原稳态。H~+ATP酶活性和脯氨酸的含量的测定表明,褪黑素可能起到调节Cd胁迫下番茄细胞的渗透平衡,以此来减轻Cd对转运通道和膜渗透性的影响,促进番茄细胞吸收、转运和积累养分。同时,褪黑素能够调节Cd胁迫下番茄叶片大量元素K、Ca、Mg和微量元素Fe、Cu、Zn、Mn的含量,维持养分平衡和胞内生理生化功能,进而缓解Cd胁迫对番茄造成的损伤。3.研究Cd胁迫下miR169b靶定TDC基因调控内源褪黑素合成的机制。首先通过HPLC-MS和实时荧光定量分别验证了Cd胁迫会促使番茄合成内源褪黑素和TDC基因的表达,并验证了Cd胁迫下,miR169b的表达量显著降低,说明miR169b在Cd胁迫下表达下调。之后通过序列比对选择了具有与TDC基因互补的miR169b,构建了miR169b-OE载体,并进行了烟草双荧光素酶实验。共表达miR169b-OE和TDC-LUC载体的烟草叶片中,LUC荧光约降低了18.3%,而当共表达miR169b-OE和TDCm-LUC载体时,LUC荧光大约降低了56.4%。突变miR169b/TDC的配对序列后,miR169b可能无法与TDC结合,因此也就无法进行剪切或者抑制翻译,直接表现就是LUC的荧光增强。实验结果表明miR169b很可能能够直接靶定TDC,对TDC的转录和翻译产生影响。
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