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目的:糖尿病是严重威胁人类健康的重大慢性疾病之一。根据最新报道,我国成年人糖尿病的患病率为10.9%,是世界上糖尿病病人最多的国家。在所有糖尿病病人中,2型糖尿病约占90-95%。尽管在过去的20年中,国内外学者对2型糖尿病进行了大量的研究工作,但其具体的病理生理机制仍不十分清楚。目前认为其发生发展因素可分为以下三类:(1)遗传易感因素;(2)胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)所致的细胞毒性;(3)与生活和饮食方式相关的风险因素等。2型糖尿病病人以胰岛β细胞功能障碍和数量显著减少、胰岛素抵抗及胰岛淀粉样蛋白沉积形成为主要病理生理学特征。其中,人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)是胰岛淀粉样蛋白沉积的主要成分。越来越多的研究表明,hIAPP诱导的胰岛β细胞功能障碍和细胞凋亡增加在糖尿病的发生发展过程中具有重要作用。因此,预防和减少hIAPP沉积可减少胰岛β细胞凋亡、改善胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。自噬-溶酶体系统是细胞降解错误折叠蛋白和受损细胞器的主要途径之一。目前研究认为自噬-溶酶体系统是胰岛β细胞清除hIAPP沉积的最主要途径。然而,一方面hIAPP可过度活化mTOR复合体1(mTOR complex 1,mTORC1),后者进一步通过磷酸化ULK1(ATG1)蛋白从而抑制自噬活性;另一方面hIAPP可破坏溶酶体膜,导致溶酶体酶的释放和自噬-溶酶体途径障碍,进而引起胰岛β细胞功能障碍和凋亡增加,造成hIAPP进一步沉积,形成恶性循环,加重糖尿病的发生发展。而自噬激动剂雷帕霉素则可与mTOR的FRB结构域结合后抑制mTOR活性,增强细胞自噬活性,促进细胞降解hIAPP沉积,保护胰岛β细胞功能、减少细胞凋亡。因此,增强细胞自噬活性有望通过促进细胞对hIAPP的降解清除,进而减轻hIAPP诱导的细胞毒性,保护胰岛β细胞功能,成为2型糖尿病治疗的一种新策略。寻找和开发能够有效防止hIAPP聚集的抑制剂是2型糖尿病研究领域的热点之一。目前hIAPP聚集抑制剂主要包括短肽类抑制剂、天然小分子化合物、金属离子、纳米材料及分子伴侣等。其中短肽类抑制剂因细胞毒性小、易于合成及可靶向结合hIAPP聚集关键区域等优点,更是受到了国内学者的广泛关注。据报道,短肽SNNFGA、GAILSS、NYGAILSS及NFGAILFF可在体外缓冲溶液中有效抑制hIAPP沉积,而腹腔注射短肽D-ANFLVH则可显著减少hIAPP转基因小鼠胰岛内的hIAPP沉积。然而短肽抑制hIAPP聚集的具体机制仍不清楚,特别是缺乏短肽对细胞自噬等生物学功能影响的实验研究。短肽FLPNF(苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸,Phe-Leu-Pro-Asn-Phe)是本研究团队经优化设计、筛选得到的hIAPP聚集五肽抑制剂,其可在体外缓冲溶液中有效减少hIAPP聚集的形成。进一步对短肽FLPNF处理后的细胞进行Label-free定量蛋白质组学分析发现,短肽FLPNF可使mTOR的下游蛋白IGF2水平下调、NPTX1水平上调,并使可被自噬降解的DVL2水平下调。上述蛋白水平变化与细胞经雷帕霉素处理后的变化情况一致,提示短肽FLPNF可影响细胞自噬活性。然而,短肽FLPNF调节细胞自噬活性的具体分子机制尚不清楚。因此,本研究拟采用大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞,通过病毒转染构建过表达hIAPP的hIAPP-INS-1细胞及过表达rIAPP(rodent islet amyloid polypeptide)的rIAPP-INS-1细胞,通过系列实验明确短肽FLPNF可增强细胞自噬活性,并阐明短肽FLPNF增强自噬活性的分子机制,探索短肽FLPNF对hIAPP诱导的细胞毒性的保护作用,为2型糖尿病的防治及新型药物的转化和研发提供理论依据。研究方法:1、合成短肽FLPNF及N末端连接细胞穿膜肽TAT的短肽TAT-FLPNF;利用Western Blot检测上述短肽对INS-1细胞内LC3蛋白水平的影响。2、利用CCK-8试剂盒,检测短肽TAT-FLPNF在不同浓度(0-400μM)和不同作用时间(24-96小时)下对INS-1细胞活性的影响。3、通过重组hIAPP及rIAPP腺病毒转染,构建hIAPP-INS-1及rIAPP-INS-1细胞。利用Western Blot检测不同浓度的短肽TAT-FLPNF对hIAPP-INS-1细胞LC3蛋白水平的影响,探索短肽增强自噬的最佳作用浓度。4、借助自噬启动抑制剂3-MA,利用Western Blot和透射电子显微镜检测短肽TAT-FLPNF处理后的hIAPP-INS-1细胞LC3、P62蛋白水平及胞内自噬体数量变化情况。5、借助自噬体降解抑制剂Bafilomycin A1,利用Western Blot检测短肽TAT-FLPNF处理后的hIAPP-INS-1细胞LC3、P62蛋白水平;通过LC3双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3腺病毒)转染构建表达mRFP-GFP-LC3的hIAPP-INS-1细胞,利用共聚焦显微镜检测短肽TAT-FLPNF处理后的hIAPP-INS-1细胞自噬体(mRFP+GFP+)和自噬-溶酶体(m RFP+GFP-)数量变化情况。6、利用Western Blot检测短肽TAT-FLPNF处理后的hIAPP-INS-1细胞内p70S6K及S6蛋白磷酸化水平,以研究短肽TAT-FLPNF对细胞PI3K-Akt-m TOR-p70S6K信号通路的影响。7、通过myr-Akt慢病毒转染,构建表达持续激活形式的Akt的HEK-293-myr-Akt细胞,利用Western Blot检测短肽TAT-FLPNF处理后,HEK-293及HEK-293-myr-Akt细胞内GSK3β、S6蛋白磷酸化水平,hIAPP-INS-1细胞内Akt、p70S6K蛋白磷酸化水平,以研究短肽TAT-FLPNF对mTORC1和mTORC2活性的影响。8、利用Flag-labeled mTOR质粒转染,构建过表达Flag-mTOR蛋白的HEK-293细胞,使用Anti-Flag免疫磁珠提取mTOR蛋白,将结合mTOR蛋白的磁珠与FITC标记的短肽FLPNF共孵育,利用流式细胞仪检测磁珠上FITC荧光信号强度,研究短肽FLPNF与mTOR结合。9、从RCSB Protein Data Bank下载FKBP12-rapamycin-FRB复合体的3D结构(PDB ID:1NSG),使用PyMOL 1.7.2.1软件提取FRB结构域的3D结构;利用ChemDraw 14.0.0.117及PyMOL 1.7.2.1软件构建短肽FLPNF的3D结构;利用AutoDock Vina 1.1.2软件预测短肽FLPNF与mTOR的FRB结构域的结合情况。10、使用FITC标记的寡聚体抗体FITC-A11,利用共聚焦显微镜研究短肽TAT-FLPNF对hIAPP-INS-1细胞内hIAPP寡聚体沉积的影响。11、利用CCK-8试剂盒检测短肽TAT-FLPNF对hIAPP-INS-1细胞活力的影响。12、利用Western Blot蛋白电泳,研究短肽TAT-FLPNF对hIAPP-INS-1细胞内Cleaved Caspase3蛋白水平的影响。13、使用胰岛素ELISA试剂盒,研究短肽TAT-FLPNF对hIAPP-INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌功能的影响。结果:1、短肽TAT-FLPNF(P<0.001)和FLPNF(P<0.01)显著增加INS-1细胞LC3-II/LC3-I比值;穿膜肽TAT不影响LC3-II/LC3-I比值。相比于短肽FLPNF组,短肽TAT-FLPNF可进一步增加LC3-II/LC3-I比值(P<0.05)。2、INS-1细胞在短肽TAT-FLPNF浓度为0-400μM下培养24-96小时,各组间细胞活力无差异。3、短肽TAT-FLPNF处理24小时,随着短肽浓度的增加,hIAPP-INS-1细胞内LC3-II/LC3-I比值逐渐增加,在短肽浓度为200μM时达到高峰(P<0.0001)。4、短肽TAT-FLPNF显著增加hIAPP-INS-1细胞内LC3-II/LC3-I比值(P<0.001),明显降低细胞内P62蛋白水平(P<0.05),该效应可被自噬抑制剂3-MA所抑制;短肽TAT-FLPNF显著增加hIAPP-INS-1细胞内自噬体数量(P<0.01)。5、在细胞自噬体降解抑制剂Bafilomycin-A1的基础上,短肽TAT-FLPNF进一步增加hIAPP-INS-1细胞内LC3-II/LC3-I比值(P<0.001)和P62蛋白水平(P<0.05);短肽TAT-FLPNF显著增加hIAPP-INS-1细胞内自噬体(RFP+GFP+)(P<0.05)和自噬-溶酶体(RFP+GFP-)(P<0.001)数量。6、短肽TAT-FLPNF显著降低hIAPP-INS-1细胞内p-p70S6K(Thr389)磷酸化蛋白水平(P<0.0001)和p-S6(Ser240/244)磷酸化蛋白水平(P<0.001),该效应不受p-p70S6K(Thr389)去磷酸化酶抑制剂OA的影响。7、短肽TAT-FLPNF显著降低HEK-293-myr-Akt细胞p-S6(Ser240/244)蛋白水平(P<0.0001),不影响p-GSK3β(Ser9)蛋白水平;短肽TAT-FLPNF显著降低hIAPP-INS-1细胞内p-p70S6K(Thr389)蛋白水平(P<0.01)和p-S6(Ser240/244)蛋白水平(P<0.0001),不影响p-Akt(Ser473)蛋白水平。8、与FITC-FLPNF共孵育的磁珠,其FITC荧光信号明显增强;短肽FLPNF通过π-π堆积作用及氢键方式与FRB结构域结合,其与FRB结构域结合的位置与雷帕霉素结合所在的位置相似。9、过表达hIAPP的INS-1细胞内的hIAPP寡聚体沉积明显增多(P<0.0001),过表达rIAPP的INS-1细胞内无寡聚体沉积;短肽TAT-FLPNF显著降低hIAPP-INS-1细胞内hIAPP寡聚体沉积(P<0.001)。10、短肽TAT-FLPNF明显提高hIAPP-INS-1细胞活力(P<0.05)。11、短肽TAT-FLPNF显著降低hIAPP-INS-1细胞内Cleaved Caspase3蛋白水平(P<0.05)。12、过表达hIAPP的INS-1细胞在高糖(20mM)刺激下的胰岛素分泌量显著下降(P<0.0001);短肽TAT-FLPNF处理组在高糖(20mM)刺激下的胰岛素分泌量是对照hIAPP-INS-1细胞组的1.26倍(P<0.0001),两组细胞在低糖(1.1mM)刺激下的胰岛素分泌量无差异。结论:相对于短肽FLPNF,短肽TAT-FLPNF具有更强的自噬增强活性;短期培养下,短肽TAT-FLPNF不影响细胞活性;短肽TAT-FLPNF增强hIAPP-INS-1细胞自噬的最佳作用浓度是200μM;短肽FLPNF通过与mTOR的FRB结构域结合,抑制mTORC1活性从而增强细胞自噬,但不影响细胞mTORC2活性;短肽TAT-FLPNF显著降低hIAPP-INS-1细胞内的hIAPP寡聚体沉积,明显减少细胞凋亡,显著改善hIAPP-INS-1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能。