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实蝇是为害水果和蔬菜的重要害虫。随着世界经济的全球化,各国之间的贸易越来越频繁,实蝇扩散入侵机率越来越高,因此实蝇类害虫在果蔬的国际贸易中受到极大关注。由于传统鉴定方法是以成虫的形态特征作为最终依据,而口岸现场截获的实蝇往往是未成熟虫态,通常需要饲养至成虫,再由专家进行鉴定。因受到时间、虫态及经验等因素的限制,使得果蔬进出口贸易的通关速度受到严重的影响,所以掌握重要有害实蝇特别是未成熟虫态的快速鉴定技术在口岸检疫中具有重要意义。根据线粒体COI(cytochrome oxidase I或coxl)片段,利用NCBI数据库以及Bioedit、Primer-Premier 5.0、Oligo 6.44 等相关软件设计了 JF190 和 JR386、NF404和 NR610、GF85 和 GR531、TF37 和 TR480、FL680 和 RL1057 共 5 对种特异性引物,分别能准确鉴定具条实蝇Bactrocera scutellata(Hendel)、南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker)、瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)、腿端黑实蝇Bactroceraatrifemur Drew&Hancock 和辣椒实蝇 Bactrocera latifrons(Hendel)。选用靶标实蝇作为阳性对照,除靶标实蝇外的其它16种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。结果显示,仅靶标实蝇能够扩增出清晰且单一的条带,分别为197 bp、207 bp、447 bp、444 bp、378 bp,其余实蝇未出现条带。利用核酸蛋白分析仪测试提取的靶标实蝇DNA模板的浓度,并将靶标实蝇DNA模板按10-1、10-2、10-3倍梯度稀释,再取不同浓度的DNA模版进行最低检出阈值的测定,具条实蝇、南瓜实蝇、瓜实蝇、腿端黑实蝇、辣椒实蝇的最低检出阈值分别为 2.889×10-2 ng/μL、5.695 ×10-1ng/μL、2.162 ng/μL、4.517×10-1 ng/μL、25.21×10-1 ng/μL。将SS-PCR鉴定方法在实际检疫工作验证,表明该方法特异性强,可应用于实蝇的疫情监测和口岸的检疫检测工作。利用种特异性COI引物快速鉴定5种果实蝇,不仅能快速鉴定实蝇的各个虫态,而且能在8 h之内完成鉴定,具有快速简便、特异性强、灵敏度高等优点,能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。