番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,在生物体中具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生理功能。目前,番茄红素市场尚处于发展阶段,主要体现在昂贵的价格和日益扩增的市场需求方面。天然提取的番茄红素面临着植物中色素含量低和纯化工艺复杂等问题。尽管化学合成番茄红素成本低廉,但是其副产物多,产品难以达到食品安全的要求。近年来,随着生物技术的蓬勃发展,利用微生物发酵生产番茄红素受到越来越多人的关注。目前,在众多产番茄红素菌株中,三孢布拉霉(Blakeslea trispora)是目前唯一实现工业化生产的菌株。本论文建立了一种三孢布拉霉高产番茄红素突变株的高效筛选策略,对发酵和提取工艺进行了优化,并从脂肪酸组成的变化分析了外源植物油促进三孢布拉霉中番茄红素积累的机理。主要研究结果如下:(1)分别利用N+离子注入、ARTP等离子体诱变和NTG诱变处理B.trsipora NRRL2896(-)孢子,经过添加三孢酸粗提液和洛伐他汀的固体筛选平板初筛,再将颜色突变株与正菌进行配对试验,根据配对试验中接合带颜色挑选出若干株菌株做摇瓶发酵复筛,最终获得三株高产番茄红素突变株。其中经N+离子诱变得到的突变株B.trsipora I5产量最高,番茄红素体积产量达到0.97 g·L-1。基因的表达量分析发现,突变株I5的类胡萝卜素合成关键基因hmg R、car RA和car B最大表达量较原始菌株分别提高了123%、80%和75%。(2)采用拓扑结构为5-12-1的BP神经网络建立培养基各组分含量与番茄红素产量的网络模型,利用遗传算法进行寻优,番茄红素产量达到1.25 g·L-1,较优化前提高了31.6%。此时,玉米粉、玉米浆、大豆油、磷酸二氢钾、硫酸镁的含量分别为41.2、8.93、26.5、1.39、0.46 g·L-1。番茄红素环化酶抑制剂的试验结果表明,在发酵48 h时添加90mg·L-1的2-甲基咪唑可获得29.5 mg·g-1的番茄红素。本文将接种方式改为非同时接种,即在负菌接种发酵培养基一定时间后,再将正菌接种发酵培养基共同培养。与传统的同时接种方式相比,番茄红素产量提高了31%。经过对接种比例和正、负菌接种间隔时间的进一步优化,得出最佳接种工艺为正菌晚于负菌24 h接种,接种比例为1:2(正菌:负菌,v:v)。(3)外源植物油的添加不仅促进了番茄红素的合成,还显著增加了生物量和胞内脂肪含量,富含亚油酸且与三孢布拉霉胞内脂肪酸组成相近的植物油效果较好,其中以大豆油效果最佳。外源植物油对胞内脂肪的影响在不同程度上促进了细胞对番茄红素的储存能力,更多的番茄红素溶于胞内脂肪中,从而削弱了游离在细胞中的番茄红素对代谢途径的抑制作用,番茄红素的产量得到提升。外源植物油还促进了碳源、ATP和NADPH流向番茄红素的合成途径中,从而促进了番茄红素的合成。(4)搅拌桨的几何形状对番茄红素发酵影响较大,轴向流的三叶推进式搅拌桨效果最好。三孢布拉霉生长阶段对剪切力较产番茄红素阶段更为敏感,分阶段的变速搅拌过程,生物量和番茄红素的产量明显优于恒速搅拌发酵。采用前期200 r·min-1,48 h后350 r·min-1的变速搅拌过程,可显著提升发酵液中的溶氧和体积氧传递系数,有利于微生物对氧的摄入。最佳通气速率为1.25 vvm,过高或者过低的通气速率均不利于番茄红素发酵。最终,30 L发酵罐中番茄红素的体积产量达到1.30 g·L-1。(5)采用KOH溶液皂化处理和超声波辅助提取可有效提高番茄红素提取率,最佳皂化条件为:KOH溶液浓度为0.6 mol·L-1,皂化时间为30 min,皂化温度为30℃;最佳萃取工艺:萃取溶剂为乙酸乙酯,超声波输出功率为300 W,料液比1:250,萃取15 min,经两级提取后,番茄红素的提取率达到92.2%。以硅胶H为柱层析填充物,经环己烷、环己烷:二氯甲烷(6.5:1)、二氯甲烷梯度洗脱,番茄红素、γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素得到了很好的分离。