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目的:血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)主要由脑微血管内皮细胞和邻近细胞间的紧密连结构成,具有选择性通透作用,其主要功能是保护脑组织,但同时也阻碍了治疗性药物进入脑内。血肿瘤屏障(Blood-tumor Barrier,BTB)具有与血脑屏障几乎相同的屏障功能,可限制抗肿瘤药物进入脑内而影响化疗效果。因此,选择性开放BTB成为治疗脑胶质瘤的理想策略。血肿瘤屏障的开放有两种途径:跨细胞途径和细胞旁途径,caveolae诱导的内化是跨细胞途径之一,而caveolin-1是形成caveolae所必需的;细胞旁途径主要是指相邻细胞间紧密连接的开放,而紧密连接相关蛋白的表达下调将引起紧密连接开放。最近有研究报道,caveolin-1对紧密连接相关蛋白有一定的调节作用,但结果不一致。在caveolin-1基因敲除小鼠,血管内皮细胞eNOS活性增加,并伴随血管功能缺陷,通透性增加;然而有研究表明caveolin-1对紧密连接相关蛋白呈负性调节,如Zhong等人在人脑微血管内皮细胞上证明,人免疫缺陷病毒-1 Tat可引起caveolin-1表达的升高,而升高的caveolin-1能够诱导紧密连接相关蛋白occludin、ZO-1和ZO-2的表达下调,从而增加血脑屏障的通透性。本研究通过构建caveolin-1重组腺病毒表达载体和沉默载体,感染脑胶质瘤模型大鼠的脑微血管内皮细胞,使caveolin-1的表达增多或减少,观察紧密连接相关蛋白及BBB通透性的改变,以明确caveolin-1对紧密连接相关蛋白的调节效果,以及对血肿瘤屏障通透性的影响,为临床开放血肿瘤屏障治疗脑肿瘤提供新的思路及理论支持。研究方法:1.构建重组腺病毒:以大鼠脑组织总RNA为模板,扩增caveolin-1全长cDNA片段,构建caveolin-1重组腺病毒表达载体。设计靶向沉默caveolin-1的小干扰RNA片断,退火合成双链DNA,构建caveolin-1重组腺病毒沉默载体。2.培养大鼠C6胶质瘤细胞,建立大鼠脑胶质瘤模型。3.将Wistar大鼠随机分成5组:对照组(C6胶质瘤+生理盐水);caveolin-1沉默组(C6胶质瘤+Ad-siRNA-Cav1);沉默阴性对照组(C6胶质瘤+Ad-siRNA-NC);caveolin-1过表达组(C6胶质瘤+Ad-Cav1);过表达阴性对照组(C6胶质瘤+Ad-EGFP),每组24只。4.接种caveolin-1重组腺病毒表达载体和沉默载体,感染脑微血管内皮细胞,使caveolin-1表达增多或减少。5.应用伊文思兰(evans blue,EB)渗透性实验检测caveolin-1重组腺病毒感染脑微血管内皮细胞后,脑胶质瘤大鼠BTB通透性的变化。6.应用Western blot法检测caveolin-1重组腺病毒感染脑微血管内皮细胞后,caveolin-1及紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的蛋白表达水平。7.caveolin-1重组腺病毒感染脑微血管内皮细胞后,透射电镜观察紧密连接超微结构的变化。8.采用SPSS13.0进行统计分析,所有数据以均数±标准差((3(3?±SD)表示,采用单因素方差分析和Bonferroni检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.成功建立了大鼠C6脑胶质瘤模型。2.成功构建caveolin-1重组腺病毒表达载体,酶切及测序鉴定结果完全相符,命名为Ad-cav1,同时构建过表达阴性对照腺病毒,命名为Ad-EGFP。3.成功构建caveolin-1重组腺病毒沉默载体,酶切及测序鉴定结果完全相符,命名为Ad-siRNA-Cav1,同时构建沉默阴性对照腺病毒,命名为Ad-siRNA-NC。4.Ad-siRNA-Cav1感染脑微血管内皮细胞48h后,脑胶质瘤模型大鼠的BTB通透性显著升高;而Ad-cav1感染大鼠的BTB通透性显著下降,对照组、沉默阴性对照组及过表达阴性对照组间无明显差异。5.Ad-siRNA-Cav1感染脑微血管内皮细胞48h后,caveolin-1及紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达显著减少;而Ad-cav1感染大鼠的caveolin-1及TJ相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达显著增加。6.透射电镜显示,Ad-siRNA-Cav1感染脑微血管内皮细胞48h后,紧密连接开放,间隙增宽;而Ad-cav1感染大鼠紧密连接非常致密,呈窄黑带状。结论:1.caveolin-1表达增多或减少能够上调或下调紧密连接相关蛋白的表达,呈正性调节作用。2.caveolin-1通过调节紧密连接相关蛋白的表达而影响紧密连接的完整性,继而影响血肿瘤屏障的通透性。